2016 Fiscal Year Research-status Report
細胞膜脂質－膜タンパク質相互作用から温度依存的TRPチャネル活性化機構を探る
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15K08198
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| Research Institution | Fukuoka Dental College |
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Principal Investigator |
内田 邦敏 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 講師 (20581135)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 人工再構成系 / 温度感受性TRPチャネル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Methyl-β-cyclodextrinによってコレステロールを除去し細胞膜脂質の流動性を変化させると、温かい温度で活性化されるTRPM5チャネルの活性はTRPV1チャネルと同様に減弱した。また、細胞骨格の影響を検討するためにcytochalasin Dの作用を検討した結果、TRPV1、TRPM8ともにチャネルの温度依存的な活性化に大きな変化はみられなかった。その他の温度感受性TRPチャネルの活性剤による活性化にも影響を与えなかった。細胞膜脂質の流動性を変化させた時のTRPチャネル活性の違いを検討するために、不飽和脂肪酸とBSAの複合体を細胞に加えることで不飽和脂肪酸を多く含んだ細胞膜になることが報告されていることから、同様の方法でHEK293細胞の細胞膜の不飽和度を大きくする方法について検討を行っている。
TRPM5チャネルの精製並びに人工脂質二重膜への再構成に成功した。これまでにTRPM5チャネルの活性化にはPIP2が必要であること、カルシウム濃度が3microM以上の時にTRPM5 チャネルの活性がみられることがわかった。温度を上昇させると40度付近までは温度依存的な活性増大が観察されるが、温度が40度をこえると活性はみられなくなった。この現象はTRPM5を強制発現させたHEK293細胞を用いたホールセリパッチクランプ法でも認められた。
また、温度感受性TRPチャネルであるTRPA1並びにTRPM2の精製、並びに人工脂質二重膜への再構成系の確立を行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
一部、今年度予定していた計画の代わりに次年度に予定していた実験を実施しているが、概ね計画書に記載した通りに進行しているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
脂質合成に異常のあるCHO細胞変異株として、PE（ホスファチジルエタノールアミン）が通常の25％程度しかない変異株（CHO変異株R-41）やPS（ホスファチジルセリン）生合成欠損株が報告されている。また、不飽和脂肪酸量を変化させたHEK293細胞やコリン非含有培地で培養することでPC（ホスファチジルコリン）合成を低下させたHEK293細胞を用いた検討を行う。これら細胞に温度感受性TRPチャネルを強制発現させ、パッチクランプ法を適用して、温度感受性の変化を検討する。脂質の含量については、質量分析法を用いて確認する。脂質の成分を完全にコントロール可能な人工リポソームを用いて、脂質とTRPチャネルのみのシンプルな実験系を構築する。GFPをfusionしたTRPチャネルを用いて、温度変化中の細胞膜の流動性とTRPチャネルの動き、特にラフトへのTRPチャネル集積の変化を共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察する。また、コレステロールもしくは脂質の温度依存的な動きとTRPチャネル活性の相関関係をイメージング法とパッチクランプ法を組み合わせ、同時測定をすることで検証する。細胞膜脂質と温度感受性TRPチャネルの温度依存性について、温度感受性TRPチャネル間で共通であったメカニズムもしくはあるTRPチャネルのみでみられるメカニズムなど、いくつかの性質の類似性もしくは相違性によって分類することが可能になると考えられる。その類似性をもしくは相違性を担っているTRPチャネルのアミノ酸配列を特に脂質からの相互作用を受けやすい膜貫通ドメインおよびその付近に注目して比較することで、機能に関連した一次構造基盤を検索する。候補配列もしくはドメイン構造について、遺伝子変異体もしくはキメラ体を作製しHEK293細胞に強制発現させ、その機能の違いをパッチクランプ法を用いて確認する。
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