2015 Fiscal Year Research-status Report

ケラチノサイトPiezo1による機械刺激受容とその役割の解明

Research Project

Project/Area Number	15K08199
Research Institution	Okazaki Research Facilities, National Institutes of Natural Sciences
Principal Investigator	鈴木喜郎大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎共通研究施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンター, 助教 (40348503)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	Piezo1 / ケラチノサイト / 機械刺激受容 / 低浸透圧
Outline of Annual Research Achievements	平成２７年度はケラチノサイト（表皮角化細胞）における機械刺激感受性チャネルPiezo1の発現の時空間的な分布を解析した。まずRT-PCRおよびWestern blottingを行い、Piezo1 mRNAおよびタンパク質が１日齢の新生仔マウスの表皮および初代培養ケラチノサイトに発現していることを明らかにした。しかしながら興味深いことにPiezo1シグナルは成体マウス表皮で減弱していた。胎仔期におけるin situ hybridizationの結果と考え合わせると、Piezo1は胎仔期および新生仔期の表皮ケラチノサイトに多く発現しており、恐らく出生前後の環境変化（浸透圧変化等）の認識に関与し、自然免疫・炎症応答の開始などに重要な役割を果たしていると考えられる。今後、表皮におけるPiezo1タンパク質の詳細な局在部位（顆粒層、有棘層、基底層）をマーカーを用いた免疫組織染色によって明らかにするとともに、初代培養ケラチノサイトにおける低浸透圧応答への関与（細胞内Ca濃度上昇に引き続く自然免疫応答・炎症開始や分化誘導との関係など）を、ウイルスによるノックダウン等の手法を用いてカルシウムイメージング、TIFMによるカルシウム応答の観察、パッチクランプ法、電子顕微鏡による解析などで明らかにしたい。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成２７年度は当初の計画では表皮ケラチノサイトにおけるPiezo1発現に加えて機能解析を行う予定であったが、発現の時空間解析を主に実施した。その結果は予想外なものであったため、それを支持する複数の種類の実験（ｍRNA、タンパクレベル）が必要となり時間がかかった。しかしながら表皮ケラチノサイトPiezo1の生理機能を推定する上で重要な知見と考えられる。平成２７年度の結果は本研究の基盤となるものであり、必要な追加であったと考えている。
Strategy for Future Research Activity	平成２８年度はPiezo1の表皮内局在を各種マーカーを用いた免疫組織染色によって明らかにすることや、初代培養ケラチノサイトにおけるカルシウムイメージング、パッチクランプ、TIRFによる観察、免疫・分化応答など機能解析に軸足を置きつつ、in vivoにおける細胞の微細構造形成への関与を明らかにするため当初の予定通りPiezo1 cKOの準備を行う予定である。速やかな研究の進展のためウイルスベクターを用いた機能解析のための準備を計画している。
Causes of Carryover	平成２７年度の物品費のうち、機能解析（一次培養を含む）にかかる費用を平成２８年度に使用することになったため差が生じた。
Expenditure Plan for Carryover Budget	差額は機能解析をより迅速に行うためのウイルスベクター作製費および機能解析のための一次培養の費用として支出する予定である。