環境ストレスで生じた遺伝子変異による難治疾患の発症解明-網羅的解析とゲノム編集-

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K08210
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 水上 洋一 山口大学, 大学研究推進機構, 教授 (80274158)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 森本 幸生 九州大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (50202362)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 酸化ストレス / 心臓 / 遺伝子変異 / 次世代シーケンサー

Outline of Annual Research Achievements

染色体DNAは、酸化ストレスや放射線などの環境ストレスによって損傷し、一部で変異が挿入され、アミノ酸配列が変化する。これらの遺伝子変異が生殖細胞に伝わる場合には遺伝病となり、出生後の環境ストレスによる体細胞変異では、特定の臓器不全などの疾患になる。癌や心筋症は、これらの体細胞変異によって引き起こされているが、疾患部位の採取が困難なことや血管など正常組織混入の問題があり十分解明されてはいない。遺伝子変異のモデル疾患として孤発性(家族歴のない)拡張型心筋症の原因変異の同定を次世代シーケンサーで行った。凍結サンプルをビーズ破砕で抽出することで高純度DNAの精製に成功し、微量組織から次世代シーケンス解析を可能にした。さらに既知の遺伝子変異を高速に解析する方法としてアンプリコンシーケンス法を開発し、10ngのゲノムDNAを1本のチューブで2986遺伝子を同時に増幅できる手法を開発した。次世代シーケンスの最適なDNA抽出を行うため組織の破砕方法を検討し、この家族歴のない拡張型心筋症からの組織および正常血液からDNA の精製を行った。既知の心筋症原因遺伝子に対するパーソナル型次世代シーケンス解析：　これまでに心筋症や不整脈など心臓疾患を発症することが報告されている57遺伝子(Elizabeth M. JCI, 2013)の2987領域に対するプライマー設計を行い、独自のカスタムパネルを作製した。このマルチプレックスPCRで57 遺伝子全領域（2987産物）の 98.3% をカバーし、平均カバレッジ200以上の良好な結果が得られた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

凍結サンプルをビーズ破砕で抽出することで高純度DNAの精製に成功し、微量組織から次世代シーケンス解析を可能にした。さらに既知の遺伝子変異を高速に解析する方法としてアンプリコンシーケンス法を開発し、10ngのゲノムDNAを1本のチューブで2986遺伝子を同時に増幅できる手法を開発した。7例のサンプルを次世代シーケンサーで解析し、世界で初めて生存時の拡張型心筋症の患者さんに存在する3箇所のアミノ酸配列に変化を起こす新規変異を発見した。

Strategy for Future Research Activity

既知の遺伝子変異では説明ができない心筋症も存在しており、未知の体細胞遺伝子変異を検出するために微量での全ゲノム解析を行う必要がある。現在、MDA法などが報告されているが、様々な問題が見つかっている。これらの問題を解決し未知の体細胞遺伝子変異を解明する必要がある。

Causes of Carryover

次世代シーケンサーの試薬が不良品であり、交換対象になったが、試薬の到着に2ヶ月以上必要だったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

既知の遺伝子変異が検出されなかったサンプルについて全ゲノムの遺伝子解析を行う。

Research Products

• [Journal Article] GSK3β heterozygous knockout is cardioprotective in a knock-in mouse model of familial dilated cardiomyopathy. (2016)
  • Author(s): Mohamed R, Morimoto S, Ibrahim I, Zhan DY, Du CK, Arioka M, Yoshihara T, Takahashi-Yanaga F, Sasaguri T.
  • Journal Title: Am J Physiol Heart Circ Physiol Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1152/ajpheart.00771.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Differentiation-inducing factor-3 inhibits intestinal tumor growth in vitro and in vivo. (2015)
  • Author(s): Kubokura N, Takahashi-Yanaga F, Arioka M, Yoshihara T, Igawa K, Tomooka K, Morimoto S, Nakatsu Y, Tsuzuki T, Nakabeppu Y, Matsumoto T, Kitazono T, Sasaguri T.
  • Journal Title: J Pharmacol Sci. Volume: 127(4) Pages: 446-455
  • DOI: 10.1016/j.jphs.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Stage-dependent benefits and risks of pimobendan in mice with genetic dilated cardiomyopathy and progressive heart failure. (2015)
  • Author(s): Nonaka M, Morimoto S, Murayama T, Kurebayashi N, Li L, Wang YY, Arioka M, Yoshihara T, Takahashi-Yanaga F, Sasaguri T.
  • Journal Title: Br J Pharmacol. Volume: 172(9) Pages: 2369-2382
  • DOI: 10.1111/bph.13062.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Urinary 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine as a novel biomarker of inflammatory activity in patients with cardiac sarcoidosis. (2015)
  • Author(s): Kobayashi S, Myoren T, Oda S, Inari M, Ishiguchi H, Murakami W, Fukuda M, Tanaka T, Okuda S, Nao T, Doi M, Yamada J, Okamura T, Hoshii Y, Suga K, Matsuzaki M, Yano M.
  • Journal Title: Int J Cardiol. Volume: 190 Pages: 319-328
  • DOI: 10.1016/j.ijcard.
  • Peer Reviewed