2016 Fiscal Year Research-status Report
ナルコレプシーにおける、より侵襲性の低い診断法の確立
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15K08224
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
本多 和樹 公益財団法人東京都医学総合研究所, 精神行動医学研究分野, 研究員 (70173656)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
児玉 亨 公益財団法人東京都医学総合研究所, 認知症・高次脳機能研究分野, 副参事研究員 (20195746)
田中 進 関西医科大学, 医学部, 講師 (30399472)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ナルコレプシー / trib2 / ataxin mouse |
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| Outline of Annual Research Achievements |
計測系セットアップに時間に時間を要したため遅れていた質量分析による新規自己抗原同定に関してはセットアップが完了し、引き続き同定を試行錯誤している。同定を試みる際の問題点として十分量かつ精製された抗原が確保されなかった事が主な原因で有り、解決策として陽性血清にてマウス視床下部組織より新規自己抗原候補を以下の方法により濃縮した。まず、マウス視床下部組織ホモジェネートと陽性血清を反応せることにより、血清中の抗体とマウス視床下部タンパクが結合しセファロースビーズに吸着させた。ProteinGを加えることにより視床下部タンパク-抗体-ProteinG複合体が形成され、それを遠心操作により沈降させる。このように精製された視床下部タンパクをSDS-PAGEにより抗体と分離させ、銀染色を行うことによりImmuno-blottingにて確認された位置と同位置にバンドが得られることを確認した。確認されたバンドをゲルより切り出し、トリプシンによるゲル内消化をおこなう。ゲル内消化サンプルをMALDI-TOF/MSにて質量分析しその配列をデータベースと照合することにより新規自己抗原を同定する。沈降サンプルを用いたImmuno-blottingにおいても同位置に陽性バンドが得られることを確認している。新規自己抗原候補として見いだされたタンパクの全長遺伝子配列をデータベースより取得して次年度の準備を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
質量分析への進行がやや遅れていたため全体にスケジュールが延びているが想定内の問題であり、原因も解明されたためほぼ順調に進行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
新規自己抗原として見いだされたタンパクの全長遺伝子配列をデータベースより取得し、PCR法によりタンパクコード領域を増幅後、pET28発現ベクターへサブクローニングする。作製発現ベクター、35S-Methionine、ならびにウサギ網状赤血球による転写翻訳システムにより35S-標識抗原を作成する。pET28およびウサギ網状赤血球転写翻訳システムの使用により、それまで困難であった全長タンパク、受容体等の膜タンパクの作成を可能で、かつこの方法により作成される抗原が立体構造を保つため立体構造認識抗体の検出が期待される。
最初に患者血清と35S-標識抗原を反応させる。次に形成された免疫複合体をProteinGセファロースにて捕捉する。96 well filterプレートによりセファロースがfilterに捕捉されるため、ProteinGに未結合の血清成分、抗体等が除去される。これにより遠心操作なしに容易に10回の洗浄操作を可能とし、それによりバックグラウンドを極限まで減らすことを可能としている。最終的に得られた35S-標識抗原-自己抗体-ProteinG複合体の放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定する。健常者血清由来の放射活性も同時に測定し、健常者の[平均値+2*標準偏差]を閾値として陽性陰性の判定を行っていく。
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| Causes of Carryover |
質量分析研究の振興が予定よりやや遅れているため経費を翌年度に持ち越しまとめて分析する必要性がある。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成29年度初めに質量分析を始める経費として用いる。
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