2015 Fiscal Year Research-status Report
ヒト多能性幹細胞および骨格筋細胞分化における脂肪酸受容体作用の解析
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15K08229
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| Research Institution | Shiga University of Medical Science |
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Principal Investigator |
今村 武史 滋賀医科大学, 医学部, 准教授 (00552093)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森野 勝太郎 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (90444447)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 脂肪酸受容体 / 幹細胞機能 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究代表者はこれまでに、ω-3長鎖不飽和脂肪酸受容体であるGPR120、および短鎖脂肪酸受容体GPR43がそれぞれに、インスリン抵抗性環境下において代謝改善作用を有することを報告した。その後我々は、GPR43およびGPR120が霊長類多能性幹細胞（ヒトiPS細胞、サルES細胞）に高発現していることを見出し、これらの受容体が幹細胞機能を亢進させることで組織再生を介した代謝改善効果を顕すのではないかという仮説を得た。そこで本研究計画では、ヒト臨床への外挿が容易な成果を目指し、培養ヒト多能性幹細胞（iPS細胞）および移植用霊長類モデルとしてカニクイザルを用いることにより、（１）ヒト幹細胞における脂肪酸受容体GPR43、GPR120作用の同定、および（２）幹細胞分化過程におけるGPR43およびGPR120受容体作用について解析する。初年度の成果として我々は、培養ヒトiPS細胞にGPR43あるいはGPR120アゴニスト、あるいはGPR120特異的小分子アゴニストあるいはアンタゴニストを24時間附置後、レゾルフィン蛍光アッセイによる幹細胞増殖能定量解析、および三胚葉特異的分化マーカー遺伝子発現量のリアルタイムPCR解析をした結果、共に有意な変化は認められなかった。一方、GPR43あるいはGPR120ノックダウン用shRNA発現ベクターを導入した脂肪酸受容体ノックダウン・ヒトiPS細胞株の樹立について、現時点で樹立できたGPR120ノックダウンiPS細胞株におけるGPR120タンパク発現量は、対照細胞株に比し約40％減少していた。今後、異なるRNAi標的配列やゲノム編集技術を用いた手法を用いて、より効率的なノックダウン細胞株の樹立を図る予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度に計画した実験項目は滞りなく実施できている。その成果として我々は、培養ヒトiPS細胞にGPR43あるいはGPR120アゴニスト、あるいはGPR120特異的小分子アゴニストあるいはアンタゴニストを24時間附置し、幹細胞増殖能をレゾルフィン蛍光アッセイにて定量解析した。その結果、ヒトiPS細胞増殖能に有意な変化は認められなかった。また、幹細胞分化能について、三胚葉特異的分化マーカー遺伝子発現量をリアルタイムPCRにより解析した結果、上記試薬附置後72時間の牛胎児血清培養条件下では有意な変化は認められなかった。
また、骨格筋細胞に分化誘導が可能なiPS-MyoD細胞（骨格筋特異的転写因子MyoD1を発現させたヒトiPS細胞）にGPR43あるいはGPR120ノックダウン用shRNA発現ベクターを導入し、脂肪酸受容体ノックダウン・ヒトiPS-MyoD細胞株の樹立を進めている。現時点で樹立できたGPR120ノックダウンiPS細胞株について検討したところでは、GPR120タンパク発現量が対照細胞株に比し約40％減少していた。
培養条件下での受容体アゴニスト、アンタゴニスト附置実験においては、予想に反してネガティブな結果が多かったが、受容体ノックダウン細胞を用いた幹細胞機能評価実験、およびサル生体内幹細胞移植実験による幹細胞機能評価を計画通り進める予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒト多能性幹細胞から機能細胞への分化過程における受容体作用を検討するため、骨格筋細胞に分化誘導が可能なiPS-MyoD細胞（骨格筋特異的転写因子MyoD1を発現させたヒトiPS細胞）を用いた解析を培養条件下、およびサル生体内幹細胞移植実験により実施する。これまでに樹立したGPR120ノックダウンiPS細胞株では、GPR120タンパク発現量が対照細胞株に比し約40％減少しているのみであった。GPR43あるいはGPR120ノックダウン・ヒトiPS-MyoD細胞株は今後、サル生体内幹細胞移植実験に用いるため、より確実な受容体ノックダウンが望まれる。
今後の改善策として、異なるRNAi標的配列を用いるshRNAベクターを追加して用いる他、ゲノム編集技術を用いる手法を検討し、効率的なノックダウン細胞株の樹立を図る予定である。改善策の実施にある程度の時間を要するが、今年度を含めて２年間の研究期間内に実験計画を終了することは可能であると考えている。
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| Causes of Carryover |
本研究計画の立案時において、物品費として培養用消耗品や核酸精製用キット等を計上していたが、初年度の実験には本研究代表者の研究室内備蓄を優先的に使用したため、当初予定の物品費に残額を生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
「今後の研究の推進方策」に上述したように、平成28年度は新たな遺伝子ノックダウン手法を採用する。その結果、当初予定した以上の物品費が必要となるため、次年度使用額はそれに充当する計画である。
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