活性酸素産生酵素NOX1による新しい心臓の線維化誘導機序の解明と治療への応用

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K08239
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 岩田 和実 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (60305571)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松本 みさき 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (80533926)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 心線維化 / 活性酸素種 / ゲノム編集 / 遺伝子組換えマウス

Outline of Annual Research Achievements

本申請の目的はCRISPR/Casによるゲノム編集を用い新たに遺伝子組換えマウスを作製し、心線維化おける活性酸素産生酵素NOX1/NADPH オキシダーゼの役割を解明することである。申請者は最近アントラサイクリン系抗腫瘍薬のドキソルビシン投与による心線維化がNOX1の遺伝子欠損マウスで抑制されるという実験結果を得た。平成27年度は、細胞特異的NOX1欠失が可能なNOX1と黄色蛍光蛋白（venus）の共発現マウスを作製しNOX1の局在および心線維化に関わる分子機序を明らかにすることを目的とした。Nox1 エクソン13の終始コドン上流の配列をターゲットとしてsingle guide RNA (sgRNA) 配列候補をCRISPRデザインツールにより決定した。導入するDNA配列として、sgRNAのターゲット配列の上および下流配列のそれぞれ500bpの相同領域でIRES (internal ribosome entry site)-venus-polyA配列を挟んだ２本鎖DNAを作製する。またNox1 エクソン13の上流と下流にloxP配列を挿入しターゲティングベクターとした。sgRNA，Cas9 発現ベクターおよびターゲティングベクターをマウス線維芽細胞株（NIH-3T3）に遺伝子導入することにより、相同組み換えによるターゲティングベクターの遺伝子導入に成功した。現在はin vitro transcriptionにより作製したsgRNAおよびCas9、およびターゲティングベクターの受精卵への導入を実施している。受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植し産仔を得る予定である。また心筋培養細胞株（H9c2）を用いた検討では、心筋死細胞由来物質が心筋生細胞におけるNox1遺伝子の発現を上昇させることを見出しており、心筋障害時におけるNox1の誘導機構を明らかにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通り組織特異的NOX1欠失が可能なNOX1と黄色蛍光蛋白（venus）の共発現マウスを作製の作製に着手しており、培養細胞株を用いた予備検討ではCRISPR/Casによるゲノム編集を用い相同組み換えによる目的遺伝子の導入に成功している。既に受精卵を用い実験を行っており、マウスの出産が確認できれば２７年度に予定していた新たな遺伝子改マウスの作製の達成となる。当該年度では作製したマウスを用いてNox1の発現局在を予定していたため、新たな遺伝子改変マウスの作製は予定より若干遅れていると考えられるが、当初２８年度以降に予定していた心筋細胞培養株を用いた心筋障害におけるNox1遺伝子の発現誘導機構の解明が予定より早く達成できていること、またマウスの横行大動脈縮窄術およびストレプトゾトシンによる高血糖による心繊維化モデルの作製にも着手しており概ね予定通りの進捗状況であると思われる。

Strategy for Future Research Activity

受精卵へのマイクロインジェクションによる遺伝子導入は専門的な手技習得が不可欠であるが、受精卵の相同組み換え効率は低いため多数の受精卵への注入が必要となると考えられる。近年、簡便かつ大量の受精卵への遺伝子導入がエレクトロポレーション法にて可能となってきている。必要であれば、遺伝子導入を新たに開発されたエレクトロポレーション法で行う。 マウスが得られた後，心繊維化モデルを作製しNox1の発現局在を同定する。発現が認められた組織特異的にNox1遺伝子を欠損させ心繊維化におけるNox1の役割を明らかにする。同時にNox1の発現を確認した細胞を用い心繊維化におけるNox1が産生する活性酸素種の作用機構を明らかにし、新たな心線維化の薬物療法の開発へと繋げる。