2016 Fiscal Year Research-status Report
細胞膜ロイシン受容体の分子同定とmTORC1シグナル経路における意義の解明
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15K08273
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
大垣 隆一 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (20467525)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中込 咲綾 大阪大学, 微生物病研究所, 特任研究員(常勤) (60423894) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 細胞内シグナル伝達 / アミノ酸 / 受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に実施した非標識定性プロテオミクスにより、細胞膜ロイシン受容体の候補分子として機能未知の膜貫通タンパク質が約40種類を見出していた。このうち特に興味深い約10種類については、siRNAによる遺伝子ノックダウン実験を実施した。ロイシン添加時のmTORC1活性への影響をウエスタンブロット法により検討した結果、いずれの候補分子についてもmTORC1活性化への寄与は認められなかった。mTORC1の活性を評価するうえで、従来のウエスタンブロット法は作業工程が複雑であり、解析のスループットも低いことから研究全体の律速段階となっていた。今後は、より多くの因子について広範な遺伝子ノックダウンを実施するため、1枚のマイクロプレートを用いて全作業工程を短時間で完了できる、スループットの高いAmplified luminescence proximity homogeneous assay法の適用を検討した。同法により、ロイシンによるmTORC1の活性化を充分なシグナル強度とダイナミックレンジで捉えられることを確認した。また結果の再現性についても迅速に確認することが可能になった。
mTORC1活性化に寄与する主要なシグナルの経路には、アミノ酸、グルコース、血清（増殖因子）が知られている。これらの経路は複雑に関連しているとされ、それぞれの重要性は充分に解明されていない。そこで、HEK293T細胞を用いて、各シグナル経路の重要性を比較した。グルコース、血清を培地から除去した場合、mTORC1の活性は12～24時間は高いレベルで維持されるが、アミノ酸を除去した場合には、1時間ほどでほぼ完全に不活性化することがわかった。グルコースや血清の欠乏は何らかの代償的な機構により相補することが可能であるが、アミノ酸のシグナルはmTORC1の活性を維持するうえで必要不可欠であることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた細胞膜画分の比較定量プロテオミクスには着手することができなかった。これは、候補因子とmTORC1の関連を検討するために実施した、遺伝子ノックダウン実験に多くの時間と労力を要したためである。従来のウエスタンブロット法による解析が、大きな律速段階となっていたため、マイクロプレートを用いた方法の適応に取り組み、解析のスループットを大きく向上させた解析系を確立することができた。これは、今後想定される大規模な遺伝子ノックダウン実験を遂行する上で重要な技術基盤となるものである。また、グルコースや血清といったmTORC1の活性化に関与する他の主要なシグナル経路と、アミノ酸シグナル経路の重要性について比較検討をおこなった。その結果、HEK293T細胞において、グルコースや血清は長時間欠乏してもmTORC1の活性に大きく影響しないが、アミノ酸のシグナルはmTORC1活性化について必要不可欠であることを明らかにした。これはmTORC1の活性化機構の全容を理解するうえで、その基本的な性質について得られた重要な知見であると考えられる。さらに、研究分野内の最近の動向によって、当初予定していなかった解析などを一部実施せざるを得なくなった経緯もある。以上のように、当初の目標に到達できていない面もあるが、全体として研究計画は概ね順調に進展しているものと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
予備的検討により得た残る約30種類の候補分子については、まだロイシンによるmTORC1活性化との関与を評価できていない。今後は、確立した新たなハイスループットのmTORC1活性評価系により、これらの候補分子について継続してmTORC1活性化への寄与を検討することを予定している。また、細胞膜濃縮画分を用いた比較定量プロテオミクスを実施し、細胞膜ロイシン受容体の候補分子の絞り込みをより高い精度で実施する予定である。得られた候補分子については、遺伝子ノックダウンによってロイシンによるmTORC1活性化が影響を受けるかどうか検討する。また、有望な候補分子については、生化学的な結合アッセイ系を構築してロイシン結合能の有無を確認する。加えて、アミノ酸変異の導入によりロイシン結合能を失わせた変異体を作成し、受容体のシグナル伝達におけるロイシン結合の機能的意義を確認する。細胞膜型ロイシン受容体としての機能実証が完了した後には、リン酸化プロテオミクスにより、受容体の下流に広がるシグナル経路の網羅的解明に取り組む予定である。
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| Causes of Carryover |
当初計画をしていた細胞膜画分の比較定量プロテオミクスの実施に至らなかったため、また光親和性分子プローブの合成をおこなわなかったため、購入を予定していた関連試薬類の一部を購入しなかった。計画を一部変更しておこなった実験もあったため、それらの実験に必要な試薬類の購入等に充てたが、使い切るには至らなかった。そのため、差額分の次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今回生じた次年度使用額は主に、細胞膜画分の比較定量プロテオミクス、光親和性分子プローブの合成に関連した試薬類の購入費に充てる予定である。また、同定された候補分子の遺伝子ノックダウンに使用するsiRNAの購入費用も比較的高額となる見込みのため、必要に応じて購入費として使用する。
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[Journal Article] Interaction of the Sodium/Glucose Cotransporter (SGLT) 2 inhibitor Canagliflozin with SGLT1 and SGLT2: Inhibition kinetics, sidedness of action, and transporter-associated incorporation accounting for its pharmacodynamic and pharmacokinetic features2016
Author(s)
Ohgaki R, Wei L, Yamada K, Hara T, Kuriyama C, Okuda S, Ueta K, Shiotani M, Nagamori S, Kanai Y.
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Journal Title
J Pharmacol Exp Ther.
Volume: 358
Pages: 94-102
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Impaired Amino Acid Transport at the Blood Brain Barrier Is a Cause of Autism Spectrum Disorder.2016
Author(s)
Tarlungeanu DC, Deliu E, Dotter CP, Kara M, Janiesch PC, Scalise M, Galluccio M, Tesulov M, Morelli E, Sonmez FM, Bilguvar K, Ohgaki R, Kanai Y, Johansen A, Esharif S, Ben-Omran T, Topcu M, Schlessinger A, Indiveri C, Duncan KE, Caglayan AO, Gunel M, Gleeson JG, Novarino G.
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Journal Title
Cell.
Volume: 167
Pages: 1481-1494
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Presentation] Inhibition kinetics, sidedness of action, and transporter-mediated uptake of the sodium/glucose cotransporter (SGLT) 2 inhibitor canagliflozin: implications for its pharmacodynamic and pharmacokinetic features2016
Author(s)
Ling Wei, Ryuichi Ohgaki, Kazunori Yamada, Taiki Hara, Chiaki Kuriyama, Suguru Okuda, Kiichiro Ueta, Masaharu shiotani, Shushi Nagamori and Yoshikatsu Kanai
Organizer
International and Interdisciplinary Symposium 2016 “Towards a New Era of Cardiovascular Research”
Place of Presentation
東京
Year and Date
2016-07-12 – 2016-07-12
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[Presentation] Inhibition kinetics, sidedness of action, and transporter-mediated uptake of the sodium/glucose cotransporter (SGLT) 2 inhibitor canagliflozin: implications for its pharmacodynamic and pharmacokinetic features2016
Author(s)
Ohgaki R, Wei L, Yamada K, Hara T, Kuriyama C, Okuda S, Ueta K, Leclercq L, Mamidi RN, Shiotani M, Nagamori S, Kanai Y
Organizer
76th American Diabetes Association Scientific Sessions
Place of Presentation
New Orleans, Louisiana, US
Year and Date
2016-06-10 – 2016-06-14
Int'l Joint Research
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