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2015 Fiscal Year Research-status Report

ニーマン・ピックC1ライク1依存性コレステロール輸送におけるORP10の役割

Research Project

Project/Area Number 15K08277
Research InstitutionTottori University

Principal Investigator

二宮 治明  鳥取大学, 医学部, 教授 (80212124)

Project Period (FY) 2015-04-01 – 2018-03-31
KeywordsNiemann-Pick C1 Like1 / コレステロール / 酸化ステロール結合蛋白質
Outline of Annual Research Achievements

Niemann-Pick C1 Like1 (NPC1L1) は小腸上皮細胞と肝細胞に特異的に発現し、細胞表面から輸送小胞を経て小胞体へコレステロールを輸送するが、分子レベルでの輸送機序には未解明な点が多数残されている。一方、ORPファミリーは、OSBP とそのホモログ (ORP1~11) 計12種類の蛋白質を含み、その各々が特定の脂質のセンサーまたはキャリアーとして働くことが明らかになりつつある。これまでに、HEK細胞での発現系を用いて、ORP10の発現を過剰にする、または抑制するとNPC1L1の細胞内局在が変化すること、さらにNPC1L1とORP10が複合体を形成することを見いだした。本研究の目的はNPC1L1依存性コレステロール輸送におけるORP10の役割を明らかにすることである。
これまでに、HepG2細胞に発現する内因性のNPC1L1とORP10の間でコレステロール濃度依存性の相互作用が生じることを確かめた。また、HEK細胞での発現系において、種々のORP10 truncated constructs とNPC1L1の共免沈実験を行い、ORP10のPHD (pleckstrin homology domain)が2つの蛋白質の複合体形成に必要であることを見出した。
さらに、ORP10がコレステロールセンサーとしてNPC1L1とNumbの結合・解離を制御するという仮説の検証を現在進めている。これと並行して、ORP10/D254とN254との機能的な違いの検討を開始した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究計画の第一の目標である、内因性のNPC1L1とORP10のコレステロール濃度依存性結合の検出に成功した。すなわち、肝細胞系の培養細胞(HepG2)で内因性のNPC1L1、ORP10の発現を確認し、免疫沈降法によって2つの蛋白質が低コレステロール条件下で複合体を形成することを明らかにした。また、免疫染色により、低コレステロール条件下で細胞表面で2つの蛋白質が共存することを示すことができた。これらの結果は、NPC1L1依存性のコレステロール輸送におけるORP10の生理的役割を検討するうえで重要な進展である。
もう一つの重要な成果として、HEK細胞での発現系において、種々のORP10 truncated constructs とNPC1L1の共免沈実験を行い、ORP10のPHD (pleckstrin homology domain)が2つの蛋白質の複合体形成に必要であることを見出した。ORP10には、PHDの他にORD(OSBP-related domain)と呼ばれる領域が存在し、この部分がにコレステロールが結合するとされている。PHDを持つがORDを持たないコンストラクトは、全長の蛋白質に比べてより効率的にNPC1L1に結合し、その結合はコレステロールに依存しなかった。この結果は、NPC1L1との複合体形成における2つのドメインの相反する機能を示唆している。すなわち、ORP10はそのPHDを介してNPC1L1と複合体を形成するが、高コレステロール条件下でORDにコレステロールが結合しているとその形成が阻害される。

Strategy for Future Research Activity

NPC1L1/ORP10複合体の生理的役割を明らかにすることを目的として、ORP10がコレステロールセンサーとしてNPC1L1とNumbの結合・解離を制御するという仮説の検証を試みる。
まず、NPC1L1とNumbの結合に対するORP10過剰発現または抑制の効果を検討する。HEK細胞での発現系および内因性のNPC1L1を発現する系を用いて、免疫沈降によりNPC1L1とNumbのコレステロール濃度依存性結合の検出し、その結合に対するORP10の過剰発現およびそのsiRNA knockdownの効果を比較検討する。次に、NPC1L1の細胞内局在に対するORP10発現抑制の効果を検証する。この仮説が正しければ、ORP10の発現量により、NPC1L1の細胞内局在が変化することが期待できる。内因性のNPC1L1とORP10のコレステロール濃度依存性結合が確認された系を用いて、ORP10 siRNA knockdownの効果を検討する。さらに、NPC1L1依存性コレステロール取り込みに対するORP10過剰発現または抑制の効果を検証する。同様に、この仮説が正しければ、ORP10の発現量により、NPC1L1依存性コレステロール輸送が変化することが期待できる。NPC1L1依存性輸送は、HEK細胞にNPC1L1を一過性に発現させ、ezetimibe感受性のRI標識コレステロール取り込み量として定量化する。この系において、ORP10の過剰発現およびそのsiRNA knockdownの効果を比較検討する。

  • Research Products

    (1 results)

All 2015

All Presentation (1 results)

  • [Presentation] NPC1L1依存性コレステロール輸送におけるORP10の役割2015

    • Author(s)
      仲宗根 眞恵 他
    • Organizer
      第88回日本生化学会
    • Place of Presentation
      神戸国際展示場〈兵庫県神戸市)
    • Year and Date
      2015-12-01 – 2015-12-04

URL: 

Published: 2017-01-06  

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