2015 Fiscal Year Research-status Report
細胞のオキシステロール産生を調節するFBS由来因子の同定と新規情報伝達機構の解明
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15K08284
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| Research Institution | Dokkyo Medical University |
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Principal Investigator |
杉本 博之 獨協医科大学, 医学部, 教授 (00235897)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安戸 博美 獨協医科大学, 医学部, 助教 (10704885)
青山 智英子 獨協医科大学, 医学部, 助教 (90420778)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | オキシステロール / 25－ヒドロキシコレステロール / コレステロール25ヒドロキシラーゼ / コレステロール / HMG-CoAレダクターゼ / ホスホエタノールアミン / シチジルトランスフェラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体膜は主にコレステロール(Cho)、ホスファチジルコリン(PC)およびホスファチジルエタノールアミン(PE)などの脂質から構成され、これら脂質の比はほぼ等量に保たれている(Cho:PC:PE=23:17:18)。これら脂質合成の律速酵素が同様な転写や活性制御を受けていると考え解析を進めてきた結果、Cho合成の律速酵素HMG-CoAレダクターゼ(HMGCR)およびPE合成の律速酵素CTP:ホスホエタノールアミン・シチジリルトランスフェラーゼ(ET)の転写や活性が、同様な容量依存性を示しながら、FBSに含まれる因子により抑制を受けることを見いだした。そこでFBSに含まれるこれら律速酵素の転写抑制因子の同定を行い、この因子がオキシステロールであることを見いだした。生体内にはコレステロールがヒドロキシル化を受けた種々のオキシステロールが存在するが、種々のオキシステロール化合物(24-ヒドロキシコレステロール(24-OHC), 25-OHC, 27-OHC)(1.25μM)によってもHMGCRやETの転写は抑制された。
そこでNIH3T3 細胞でも生理的条件下で細胞内オキシステロール量の変化がおきる可能性を考え、オキシステロールを合成する種々の律速酵素に注目したところ、その中でも25-OHCを産生するコレステロール25ヒドロキシラーゼ(CH25H)が培養液中のFBS濃度の増加により転写抑制を受けることを見いだした。
本研究では、①C18-HPLC、MALDI-TOF/MS、LC-MS/MS を用いてCH25Hの転写を抑制する因子をFBS から精製し同定する。②同定した本因子によりどのような情報伝達機構によりCH25H の転写が抑制されるのか解明する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
FBSに由来し、細胞への添加によりコレステロール25-ヒドロキシラーゼ(CH25H)の転写を抑制する因子の同定を、NIH3T3細胞を用いて、本因子を含む画分を添加後、mRNA抽出、RT-PCRを行うことで確認し進めている。意外にも、この因子はFBSをBligh-Dyer法で分画した脂溶性画分には認められず、水溶性画分に認められた。この水溶性分画を逆層HPLCによりさらに精製をすすめたところ、アセトン/DWで溶出する分画(Fraction 12)に抑制性の活性が認められた。現在この因子をLC-MS/MSやTOF-MSにより同定を進めている。
CH25Hのタンパク質レベルでの増減を解析するため、大腸菌にHis-tag酵素を発現させ、キレートカラムで精製した。この精製タンパク質を用いて抗体を作成したところ、内因性の酵素が検出できるようになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
FBSに由来し、細胞への添加によりコレステロール25-ヒドロキシラーゼ(CH25H)の転写を抑制する因子の同定を進めている。この因子はFBSをBligh-Dyer法で分画した水溶性画分に認められた。この水溶性分画を逆層HPLCによりさらに精製をすすめたところ、アセトン/DWで溶出する分画(Fraction 12)に抑制性の活性が認められた。現在この因子をLC-MS/MSやTOF-MSにより同定を進めている。精製分画を熱処理、プロテアーゼや糖鎖分解酵素などで処理をして、その活性の有無を確認する。
CH25Hのタンパク質レベルでの増減を解析するため、大腸菌にHis-tag酵素を発現させ、キレートカラムで精製し、抗体を作成したところ、内因性の酵素が検出できるようになった。細胞に血清由来因子を加え、タンパク質レベルではどのようにタンパク量が増減するのか解析する。
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| Causes of Carryover |
FBSに由来するCH25Hの転写抑制因子を逆層HPLCにより精製を行っているが、HPLCによる精製を繰り返すことで同定に利用する転写抑制因子の収量を増やすための研究を進めており、費用がかからなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今後は、FBSに由来するCH25Hの転写抑制因子を同定するため、LC-MS/MSやTriple-TOF-MSを用いたり、処理を行う各種試薬を購入すすめるための費用に当てる。
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