2017 Fiscal Year Research-status Report
細胞のオキシステロール産生を調節するFBS由来因子の同定と新規情報伝達機構の解明
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15K08284
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| Research Institution | Dokkyo Medical University |
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Principal Investigator |
杉本 博之 獨協医科大学, 医学部, 教授 (00235897)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安戸 博美 獨協医科大学, 医学部, 助教 (10704885)
青山 智英子 獨協医科大学, 医学部, 助教 (90420778)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | コレステロール25-ヒドロキシラーゼ / 25-ヒドロキシコレステロール / オキシステロール / HMG-CoAレダクターゼ / シチジリルトランスフェラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内のオキシステロールを主に産生する酵素はコレステロール25-ヒドロキシラーゼ(CH25H)であり、コレステロールの水酸化を行い、コレステロールから生理活性を有する25-ヒドロキシコレステロールを産生する。最近の研究から申請者はFBS中に細胞レベルでCH25Hの転写を抑制する因子が存在することをはじめて見いだした。生成物阻害を考慮しオキシステロールをNIH3T3細胞に添加したが、CH25Hの転写レベルに変化はなかった。このことは、細胞膜脂質の産生を行う酵素HMG-CoAレダクターゼ(HMGCR)(コレステロール合成の律速酵素)やCTP:ホスホエタノールアミン・シチジリルトランスフェラーゼ(ET)(ホスファチジルエタノールアミン合成の律速酵素)の転写がFBS中のオキシステロールにより抑制される機構と、CH25Hの転写がFBSにより抑制される機構は大きく異なることを示す。そこで、FBS由来の精製分画をNIH3T3細胞に添加し、CH25HのmRNA量をRT-PCRにより測定することでFBSに由来するCH25H転写抑制因子の精製を試みた。その結果、本抑制因子はBligh-Dyer法の水溶性画分に存在し、オキシステロールのような脂質分子ではないことが強く示唆された。この水溶性抑制因子の分子レベルでの同定を試みるため、FBSをBligh-Dyer法で分画した水溶性画分を逆相C18HPLCにより分画することで、本因子の精製を試みた。その結果、CH25H転写抑制因子は逆相C18カラムに結合しアセトニトリルにより溶出する分子であることが明らかになった。現在本因子の分子レベルでの同定を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
FBS中に細胞レベルでCH25Hの転写を抑制する因子が存在し、Bligh-Dyer法で分画した水溶性画分に存在することをはじめて見いだした。そこでFBSをBligh-Dyer法で分画した水溶性画分を逆相C18HPLCにより分画することで、本因子の精製を試みた。その結果、CH25H転写抑制因子は逆相C18カラムに結合しアセトニトリルにより溶出する分子であルことが明らかになった。この抑制因子の分子量フィルター解析や、protease Kおよびglycopeptidase Fの処理により失活することから糖タンパク質ではないかと推測している。今後推測分子に即したカラムによりさらに精製を進め、本分画を本大学で保有するTriple-TOF/MS (Sciex 6600)、LC-MS/MS分析装置(Sciex 5500)により解析することでその分子を同定する。分子の同定が困難な場合には候補になる可能性のある糖タンパク質を高発現させ、この高発現タンパク質を細胞に添加することで同定を試みる。本分子の同定は間近と思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
この抑制因子の分子量フィルター解析や、protease Kおよびglycopeptidase Fの処理により失活することから糖タンパク質ではないかと推測している。今後推測分子に即したカラムによりさらに精製を進め、本分画を本大学で保有するTriple-TOF/MS (Sciex 6600)、LC-MS/MS分析装置(Sciex 5500)により解析することでその分子を同定する。さらに今後は、本因子を細胞に添加する事でどのようなシグナル伝達によりCH25Hの転写抑制が行われるのか解析する。LC-MS/MS分析装置(Sciex 5500)により細部内内因性各種オキシステロールを同定し、その絶対量や抑制因子によるオキシステロール量の変化を解析し、生理的状況での細胞内シグナル伝達への関与を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
この抑制因子の分子量フィルター解析や、protease Kおよびglycopeptidase Fの処理により失活することから糖タンパク質ではないかと推測している。現在推測分子に即したカラムによりさらに精製を進め、本分画を本大学で保有するTriple-TOF/MS (Sciex 6600)、LC-MS/MS分析装置(Sciex 5500)により解析することでその分子の同定を試みているところで、候補となる因子はいくつか見出したが同定には至っていないため、更なる研究が必要である。また今後は、本因子を細胞に添加する事でどのようなシグナル伝達によりCH25Hの転写抑制が行われるのか解析する予定である。LC-MS/MS分析装置(Sciex 5500)により細部内内因性各種オキシステロールを同定し、その絶対量や抑制因子によるオキシステロール量の変化を解析し、生理的状況での細胞内シグナル伝達への関与を明らかにする。
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[Journal Article] Changes of plasmalogen phospholipid levels during differentiation of induced pluripotent stem cells 409B2 to endothelial phenotype cells2017
Author(s)
Yusuke Nakamura, Yasuo Shimizu, Yasuhiro Horibata, Rinna Tei, Ryosuke Koike1, Meitetsu Masawa, Taiji Watanabe, Taichi Shiobara, Ryo Arai, Kazuyuki Chibana, Akihiro Takemasa, Hiroyuki Sugimoto, Yoshiki Ishii
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 7
Pages: 1-9
DOI
Peer Reviewed
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