2016 Fiscal Year Research-status Report
GATA転写因子によるマスト細胞プロテアーゼ遺伝子の統括的な発現制御機構の解明
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15K08285
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| Research Institution | Takasaki University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
大根田 絹子 高崎健康福祉大学, 薬学部, 教授 (50323291)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石嶋 康史 高崎健康福祉大学, 薬学部, 講師 (10433640)
大森 慎也 高崎健康福祉大学, 薬学部, 助教 (10509194)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | マスト細胞 / 転写因子 / 遺伝子発現制御 / プロテアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マスト細胞特異的なトリプターゼをコードする遺伝子群は、染色体上にクラスターを形成している。マウスでは、mMCP-6・mMCP-7をコードするTpsb2・Tpsab1などのトリプターゼ遺伝子群はChr17A3.3に存在している。研究代表者らは、転写因子Gata1またはGata2を欠失させたマウス骨髄由来マスト細胞（BMMCs）を用いて、トリプターゼ遺伝子群の発現がGATA因子に強く依存していることを報告した（Ohneda et al., Mol Cell Biol., 2014, Omori et al., Blood, 2015）。また、Chr17A3.3にGATA結合配列が集積する約500bpの領域（RegionA）が存在し、この領域にGATA1、GATA2が結合していることを見出した。本研究では、これらの結果を踏まえて、GATA因子がどのような分子機序でトリプターゼ遺伝子群の発現を制御しているのか解明することを目的とする。H28年度は、1) マスト細胞株BRC6を用いたゲノム編集法により、Tpsb2発現に対するRegionAの貢献を明らかにしたこと、2) クロマチン免疫沈降法（ChIP）により、RegionAやTpsb2プロモーターへのGATA1とGATA2の結合が、相互に依存していることを見出したこと、3) マスト細胞特異的CreERマウスの作製が進展したこと、などが主な成果として挙げられる。特に、2)では、GATA1をノックダウン（KD）すると、RegionAやTpsb2へのGATA2の結合が著しく低下し、逆にGATA2をKDすると、同領域へのGATA1の結合が低下することを見出した。これらの結果から、Chr17A3.3におけるトリプターゼ遺伝子群の発現制御においては、GATA1とGATA2の双方が相互に代償不能な役割を担っていると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H27年度にBMMCs を用いてCRISPR-Cas9システムによるゲノム編集によってRegionAを欠失させ、その機能的貢献を検証することを試みた。ところが、ゲノム編集に必要なCas9 とガイドRNAを発現させるプラスミドDNAをBMMCsに高効率・高生存率で導入することは技術的に困難であった。そのため、H28年度には、マスト細胞株BRC6を用いて同様の実験を試みた。その結果、RegionAを欠失させることで、mMCP-6mRNA量が顕著に低下するという結果を得た。また、クロマチン免疫沈降法（ChIP）により、RegionAやTpsb2プロモーターへのGATA1とGATA2の結合が、相互に依存していることを見出した。具体的には、siRNAでGATA1をノックダウンすると、RegionAやTpsb2へのGATA2の結合が著しく低下し、逆にGATA2をノックダウンすると、同領域へのGATA1の結合が低下した。興味深いことに、マスト細胞におけるGATA因子の標的遺伝子であるKit -114KへのGATA1とGATA2の結合は、独立しており、ノックダウンしてもお互いに影響はみられなかった。現在、なぜGATA1とGATA2の結合が相互に影響を受けるのかを解析している。本研究では、GATA因子によるトリプターゼ遺伝子の統括的発現制御機構の生物学的意義を明らかにするため、個体レベルでマスト細胞特異的にGATA1またはGATA2を欠失させ、トリプターゼの機能異常を様々な病態モデルで解析する実験計画を予定している。そのために、H27年度からマスト細胞特異的にCreERを発現するトランスジェニックマウス作製を試みていたが、試行錯誤を経て、H28年度にようやくF0個体が得られた。今後、ライン化し、Gata1またはGata2のfloxマウスと交配する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
H27年度は、いくつかの実験に技術的な困難があったため、進捗状況としては「やや遅れている」と判定せざるをえなかった。H28年度は、これらの技術的な困難を克服し、研究を進める上で重要な知見や、有用な実験材料を得ることができた。RegionAの必要性を示す結果は、BRC6細胞でゲノム編集法によるRegionA欠失の効果を確認できたが、材料または方法を変えて、より強固なエビデンスを得られるようにする。RegionAやTpsb2へのGATA1とGATA2の結合が相互に依存しているというChIP解析の結果は、トリプターゼ遺伝子群の発現制御メカニズムに迫る新しい発見である。DNAのシス配列や、GATA1、GATA2以外にこの領域に結合するトランス因子など、多角的な観点から解析を進めていきたい。マスト細胞特異的且つ誘導的なCreトランスジェニックマウスについては、交配開始が予定より遅れてしまったが、当初予定していた計画どおりの実験ができるように、コンパウンドマウスの準備を進めたい。
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