2016 Fiscal Year Research-status Report
がん抑制遺伝子(PITX1)の機能解析による細胞老化分子メカニズムの解明
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15K08304
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| Research Institution | Tottori University |
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Principal Investigator |
久郷 裕之 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (40225131)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 細胞老化 / SASP / ＰＩＴＸ１ / がん抑制遺伝子 / IL-6 / テロメレース / 炎症反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度はPITX1のSASP経路への関与をより詳細に明らかにする目的で、①FLAGタグを用いたプルダウン解析および②in vivo解析に向けたpitx1のコンディショナルノックアウト(Pitx1 CKO)マウスの作製を行った。
①については、HeLa細胞に加えて293T細胞およびU2OS細胞を用いてFLAGタグを付加したPITX1を安定発現する細胞株を樹立した後、FLAG-PITX1タンパクの発現解析を行った。次に、FLAGをターゲットとした抗体によるプルダウンとLC/MS/MS解析によりPITX1に直接結合する分子群を検索した。その結果、当初予定していたPKD1との関連については直接的な知見は得られなかったが、hnRNPAをはじめとするSASPとの関連が報告されている因子を含む新規のPITX1関連遺伝子の候補を見出した。現在は、これら因子についての機能の特徴からPITX1によるIL-6,IL-8の発現誘導とSASP経路とを結ぶ分子機序について具体的な実験を行っている。
②Pitx1 CKOマウスを作製するために、文部科学省の動物作製支援(先端モデル動物支援プラットフォーム)のもと、ゲノム 編集技術(CRISPR/Cas9システム)を用いて、マウスES細胞へのPitx1 loxP/loxP遺伝子変異導入、Pitx1のエクソン2番をCre/loxPシステムによって欠損させることできるマウスES細胞の樹立に成功した。現在は得られたES細胞を用いてキメラマウスの作製を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
プルダウン解析の結果から、PITX1によるIL-6およびIL-8の発現誘導における関連因子の候補を獲得できたことにより、SASPにおけるPITX1の役割について検討をするための具体的な分子経路を予測できことに加えて、Pitx1のCKOマウスの作製において、マウスES細胞でのターゲティングが順調に進んだことから、in vivoでのPitx1とSASPの関連を解析する体制が整いつつあるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
PITX1によるIL-6およびIL-8の発現誘導経路とSASPとの関連性を明らかにするために、プルダウン解析から得られた候補因子を足掛かりに、その分子経路を探る。具体的には、PITX1の過剰発現条件下で認められるIL-6,IL-8の発現誘導の経路の中で、候補因子の発現動態解析を行いキー因子の同定に繋げる。加えて、ヒト正常線維芽細胞株IMR90細胞を用いた細胞老化モデルにおけるSASP現象において、新たに同定した経路が再現できるか否かを検討し、最終的なPITX1とSASPとの関連性を明らかにする。
また、Pitx1をターゲティングしたES細胞からPitx1 -CKOマウスを作製し、Cre-エストロゲンレセプターを仕組んだマウス(ER-Cre)と交配させ、エストロゲン誘導体であるタモキシフェンにより全身性にCreを発現するPitx1-CKO マウスを作製する。Pitx1-CKO マウスは、Cre発現後に、SASPにより直接誘導される肥満肝がんモデルを用いて、発がんへの影響の検証し、さらに老化現象の解析が行い易い、骨、筋肉、神経細胞から得られた組織サンプルの形態観察、老化細胞マーカーであるp21,p16での組織化学免疫染色法での解析、さらにその抽出物から IL6, 8 を含むサイトカイン系の発現動態変化を mRNA およびタンパク質レベルで検討し、Pitx1を軸とした炎症性因子の発現誘導と細胞老化およびSASP現象の全体像を明らかにしたい。
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