2017 Fiscal Year Research-status Report

腎尿細管特異的SAV1ノックアウトマウスによる腎癌悪性化のメカニズム解明

Research Project

Project/Area Number	15K08348
Research Institution	Oita University
Principal Investigator	松浦恵子大分大学, 医学部, 教授 (00291542)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2019-03-31
Keywords	腎癌 / 悪性化 / ノックアウトマウス / SAV1
Outline of Annual Research Achievements	腎癌の中でも最も多い腎淡明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma: ccRCC)には、予後が比較的良好な低悪性度ccRCCと、予後不良とされている高悪性度ccRCCに分けることができる。これらのゲノム（染色体）の異常を比較し、高悪性度ccRCCにだけ特異的にみられるゲノムの異常を解析したところ、低悪性度ccRCCと比べると高悪性度ccRCCでは１４番染色体の欠失が有意に高頻度に見られた。14番染色体の欠失により発現が低下する遺伝子を網羅的に調べ、14番染色体にあるSAV1遺伝子が重要であることがわかった。SAV1は腫瘍抑制に働くHippoパスウェイの主要因子であることが知られている。そこで実際にSAV1遺伝子が腎癌の悪性化にどのように関わっているかを調べる目的で、SAV1遺伝子を腎臓でのみ働かないようにするノックアウトマウスを作成し、個体レベルでの機能解析を行っている。平成29年度には、平成28年度に作成したSAV1片アレル欠失(ヘテロ)と両アレル欠失(ホモ)マウスの個体数を増やし、腎組織の形態変化をさらに継続し、腎癌の発症モデルとなりうるかどうかを検証した。またHippoシグナル分子の活性化状態を遺伝子レベルで調べ、実際にどのような細胞内シグナルに影響しているかどうかをパスウェイ解析した。この解析で異常パスウェイを同定することにより、悪性化腎癌の治療応用に役立てることができる。さらに、VHLコンディショナルノックアウトマウスと交配させ、ダブルノックアウトマウスを作製した。VHL遺伝子は、腎癌の発症の初期に重要であることは知られているが、SAV1との関係は知られていない。この関係を明らかにすることによって実際のヒト腎癌で認められた遺伝子変化により近づけることにつながり、腎癌発症および悪性化メカニズムを解明できる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 平成28年度には、SAV1ノックアウトマウスの片アレル欠失(ヘテロ)と両アレル欠失(ホモ)マウスを作成し、腎組織の形態変化、Hippoシグナル分子の活性化状態を調べ、SAV1遺伝子は腎臓の尿細管上皮の核の大きさを制御し、ネフロン構造の維持に重要な生理機能を果たしていることを明らかにした。平成29年度にはこれらノックアウトマウスを維持し、かつ継続的に飼育した。さらにノックアウトマウスの腎組織の一部からRNAを抽出し、DNAマイクロアレイによりトランスクリプトーム解析を行った。網羅的遺伝子解析の結果コントロールマウスと比較して有意にホモマウスで発現変動を認める遺伝子を、IPA(Ingenuity Pathway Analysis) を用いてパスウェイ解析を行った。SAV1ホモマウスでは、コントロールと比較すると免疫系、細胞間の相互作用あるいは代謝系に関わるパスウェイの異常が認められたこれらのパスウェイの異常が腎臓の尿細管上皮の核の大きさあるいはネフロン構造の変化に関わっていることが示唆された。次に、VHLコンディショナルノックアウトマウスから、SAV1と同様の年齢での腎組織を採取した。形態学的変化を観察すると、腎臓には細胞異型の乏しい嚢胞を生じたのみであった。VHL とSAV1のノックアウトマウスの交配により得られたダブルノックアウトマウスは、個体数は少なかったが、観察した限り、嚢胞壁の異型の増強は認められなかった。これらのことから、VHLとSAV1は独立して腎の構造変化に関わっていることが示唆された。ただし、大学運営業務が多忙であったことに伴い、当初計画が遅延した。また平成29年度には、SAV1のホモのノックアウトマウスあるいは、VHLとのダブルノックアウトマウスの繁殖数が少なかったこと等のため一部研究計画が変更になり、解析が終了しなかった。
Strategy for Future Research Activity	作製したSAV1単独、VHL単独、SAV１・VHLダブルノックアウトそれぞれ染色体の片アレル欠失(ヘテロ)と両アレル欠失(ホモ)マウスについて、腎組織の形態変化、Hippoシグナル分子の活性化状態（リン酸化の状態や細胞内局在の変化）の解析を行うことにより、それぞれの遺伝子の独立性あるいは関連性をさらに追及する。ダブルノックアウトマウスは、生まれる個体数が少なかったため、個体数を増やす工夫（例えば餌や交配年齢の条件を検討する）をこらし、解析する個体数を増やす。またVHLホモマウスとSAV1ヘテロマウスを交配し、それぞれの遺伝子の欠失レベルが同程度必要であるかどうかを検討する。
Causes of Carryover	大学運営業務が多忙であったことに伴い、当初計画が遅延したこと、および一部研究計画が変更になったためである。また平成29年度には、SAV1のホモのノックアウトマウスあるいは、VHLとのダブルノックアウトマウスの繁殖数が少なかったこともあり、解析が終了しなかった。平成30年度には解析すべきマウスもそろってくる予定であり、物品費は使用できる。また結果の報告や資料収集のための旅費も平成30年度に使用できる。