2015 Fiscal Year Research-status Report
In situ LAMP法を用いたFGFR3変異陽性膀胱癌細胞の可視化法の開発
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15K08387
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
山崎 一人 帝京大学, 医学部, 准教授 (60302519)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 膀胱 / 尿路上皮癌 / FGFR3 / hTERT / 遺伝子変異 / in situ PCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度は非筋層浸潤性膀胱尿路上皮癌100例のパラフィン包埋標本を用いて，Sanger法にてFGFR3遺伝子変異の有無を検索した．
変異を確認し得た70例（R248C, もしくは，S249C），変異陰性例30例を対象とし，変異遺伝子を特異的に増幅するPCR法について検証した．検討対象のパラフィン包埋標本からmRNAを抽出し，RT-PCR法にてFGFR3 exon7領域を含むcDNAを作成した．作成したcDNAを鋳型とし，C端がR248C, S249C変異塩基に相補するプライマーを複数作成し，PCR法にて変異を有する遺伝子のみが増幅されるallele-specific PCR法を確立した．この手法によって増幅されたDNAはアガロースゲルにおける電気泳動で容易に検出が可能となった。
現在，上記手法で用いたプライマーをビオチン標識し，in situ LAMP 法を用いて組織切片上での変異遺伝子の増幅を行っている．可視化のためには遺伝子増幅に加えて，プライマー標識に用いたビオチンを免疫組織染色にて検出する必要があるが，非特異反応が比較的多く見られたため，現在可視化のための条件設定を検討中である．
以上の課題を補う目的で，検討項目を1つ追加した．近年膀胱尿路上皮癌において，テロメラーゼの活性化サブユニットであるhTERT遺伝子のプロモータ領域で点突然変異の頻度が高いことが報告されている．hTERTはテロメラーゼ構成蛋白のひとつである逆転写酵素をコードし，そのプロモーター領域に2カ所のhot spot が存在する．この変異は当研究の対象症例においても64%に同様の変異が存在することが判明している．以上の結果を鑑みるに，FGFR3遺伝子と同様に，hTERTにおける変異を同定するアッセイの確立を検討中である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
FGFR3遺伝子の変異の検出が可能となれば，膀胱尿路上皮癌のおよそ70%がカバーできることになるが，尿細胞診材料を用いたスクリーニングとしては感度が充分とは言えない．hTERTにおける遺伝子変異は膀胱尿路上皮癌の60-70%に見られるため，FGFR3, hTERT遺伝子の双方が検出可能であれば， 膀胱尿路上皮癌の95%程度をカバーし得るものと考えられる．両者の変異を同定するアッセイが確立をを検討中であり，hTERT遺伝子の変異を検索するのにやや時間を要したことが，進捗がやや遅れた原因となった次第である．研究実績の概要で記した内容については，平成28年5月に開催される日本病理学会総会で発表を予定しており，その後この内容での論文発表も予定している．
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| Strategy for Future Research Activity |
膀胱尿路上皮癌に特異的な遺伝子変異の可視化という，一つのテーマに沿って一通りの研究成果を得ている．但し，臨床材料を用いたアッセイの確立には，非特異的な反応を極力抑えて特異度を上げる必要がある．当初FGFR3変異遺伝子に対応するmRNAの検出のみを検討対象としてきたが，膀胱尿路上皮癌においてはhTERTプロモーター領域における遺伝子変異の頻度がFGFR3遺伝子における変異頻度と同等であり，こちらに関しても変異部位を同等し得るアッセイの確立を目指したいと考えている．
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| Causes of Carryover |
平成27年度予算のうち，平成28年2,3月に購入した物品の支払いがまだ完了しておらず，次年度に支払いを持ち越しした．また，先に述べたように，対象症例における遺伝子変異の有無を検索するのに時間を要したため，in situ PCRの進捗がやや遅れたこともあって残額が生じた．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究計画に則して課題の遂行を行う．また，研究課題の発表に関連した旅費，および，英文論文に関連した校正料，投稿料を予定している．
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