2015 Fiscal Year Research-status Report
STAT3シグナルにおけるVCP、UBL4A(GdX)の関与の検討
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15K08391
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| Research Institution | Research Institute, Osaka Medical Center for Cancer and Cardiovascular Disaeses |
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Principal Investigator |
冨田 裕彦 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪府立成人病センター(研究所), その他部局等, その他 (60263266)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | VCP / GdX / STAT3 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒト由来膵癌細胞株Panc1、PSNを用いて、GdXの局在に関する検討を行った。
まず、核、細胞質それぞれの分画におけるGdXの発現を計測するためWestern blotを行った。GdX自体の発現量が多くないこと、あるいは、操作の途中での障害等により、実験間でのばらつきが多く、GdXの発現量を定量的に検討するに至っていない。蛍光免疫染色においても、局在の同定が困難であった。IL6, TNFα, EGFなどの刺激により、GdXが核から細胞質に、あるいは細胞質から核に移行することを検証するモデルの構築中であるが、培養細胞中に存在するGdX自体をターゲットとする検証は上記の理由を含めてまだ確立されていない。
これと並行して、VCPノックアウトマウスの作成を開始した。まずVCP遺伝子に対する相同組み換えベクターを作成、エレクトロポレーション法にてES細胞に導入し、20個のクローンを単離した。PCR法により、そのうち13個のクローンに組み換えを確認した。このES細胞をマイクロマニピュレーターを用いて胚盤胞期胚に注入し、キメラマウスの作製を開始した。通常の交配では妊娠は確認できなかったので、検討してみると、キメラマウスの運動精子が少ないことが明らかになった。透明体部分切開法を用いて体外受精を試み、受精卵を27個得ることができた。しかしながら、得られた産子は離乳に至らず死亡したので、現在ヘテロマウスを獲得できていない状態である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
GdXの局在解析、修飾解析を行うことを第一の目的として平成27年は研究を行ってきたが、安定した結果はまだ得られていない。
ノックアウトマウスに関しては、ES細胞の状態が悪いことが考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
かつて報告した蛍光融合タンパク質を用いるモデルでこれらを再構成し、研究を行い、そのうえで、再び細胞内のGdXの解析を行うほうが効率的であると考える。
ノックアウトマウスに関しては、ES細胞の状態が悪いことが考えられるので、凍結してある他のES細胞を用いてキメラマウスの作製を再び行うことを目指す。
さらに平行して、VCPトランスジェニックマウスの作製も行っていくことにした。
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| Causes of Carryover |
本年度は他の研究費を用いて物品費その他に使用したため、科研費は次年度使用としました。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
2016年度においても、他の研究費と調整のうえ、使用額を3年間の研究期間のなかで効率よく配分していきたいと考えます。
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