2016 Fiscal Year Research-status Report
DNA脱メチル化技術を用いた前立腺癌細胞増殖に関与する高度メチル化遺伝子の探索
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15K08392
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
福重 真一 東北大学, 医学系研究科, 准教授 (90192723)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 癌 / ゲノム / 遺伝子 / 発現制御 / 前立腺癌 / 細胞増殖 / アポトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAメチル化は、癌関連遺伝子発現を抑制し、高い増殖能力、不死化、浸潤、転移など癌の特徴に影響を及ぼすため、癌の診断、治療標的として重要である。しかし、一般に、癌細胞には多数のメチル化異常が見られ、どれが癌の特徴に関連するのか見出すことは難しい。我々は、メチルCpG結合ドメイン（MBD）と転写因子NFkBの転写活性化ドメイン（AD）、あるいは、TET1蛋白（Ten-eleven translocation protein 1）の触媒ドメイン（TET1-CD）を用いたゲノムワイドなDNAメチル化遺伝子再活性化法を開発し、いずれの方法でも前立腺癌細胞株LNCaPの増殖が著しく抑制されることを見出した。本研究では、これらの系を用い、前立腺癌細胞の増殖に関与するメチル化遺伝子を探し出し、DNAメチル化による細胞増殖促進メカニズムや診断バイオマーカー、治療標的としての可能性について明らかにすることを目的とした。
前立腺癌細胞株LNCaPのNFkB(AD)-MBD発現誘導系の解析により細胞増殖抑制の原因としてアポトーシスが誘導されることを見出した。マイクロアレイ解析によりアポトーシス誘導因子としてPYCARD、TNFRSF25の２遺伝子が著しく発現誘導されることが明らかとなった。このうち、PYCARDプロモーター領域は正常前立腺細胞株でメチル化されておらず、前立腺癌細胞株においてのみメチル化が見られた。一方、TNFRSF25プロモーター領域は正常前立腺、前立腺癌細胞株ともにメチル化されていた。マイクロダイセクターを用いて、20症例の臨床検体パラフィンブロックから癌部と近傍正常部を分取後、メチル化特異的PCR（MSP）法で解析した結果、PYCARDは細胞株での結果同様、癌特異的に高率でプロモーター領域のメチル化が見られることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前立腺癌の細胞増殖、アポトーシスに関連する因子としてPYCARDを同定したため。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、PYCARD遺伝子についてさらに30症例の臨床検体からマイクロダイセクターで癌部、近傍正常部を分取し、メチル化解析を進め、合計50症例についてのデータをまとめる。次に、免疫染色をおこない、メチル化解析の結果と比較する。
また、同定されたPYCARD遺伝子の性状を解析するため、cDNAライブラリーからcDNAを単離し、発現ベクターにクローニングする。次に、発現コンストラクトを前立腺癌細胞株にトランスフェクションし、アラマブルーアッセイによってPYCARD遺伝子の発現回復が細胞増殖抑制を引き起こすかどうか明らかにする。また、同時に、DNA脱メチル化剤やヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）阻害剤を用いた細胞増殖能への影響をアラマブルーアッセイにより、PYCARD遺伝子の脱メチル化をバイサルファイトシークエンス、MSP法にて解析し、脱メチル化剤、HDAC阻害剤がPYCARD遺伝子の発現に及ぼす影響を明らかにする。また、軟寒天培地を用いてPYCARD遺伝子の回復による足場非依存的増殖能における変化をin vitroで検討する。in vitroで足場非依存的増殖能の低下が見られる場合、さらに、PYCARD遺伝子の発現誘導細胞株を作製し、ヌードマウスへの接種によりex vivoでの癌の進行や腫瘍サイズにおける変化等について検討する。これらの結果から、高メチル化PYCARD遺伝子と癌化との関連について考察する。
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| Causes of Carryover |
消耗品購入に際し、キャンペーンにより若干の余剰が生じたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
細胞培養等で使用する消耗品に使用する予定である。
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Research Products
(4 results)
