2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K08397
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
華表 友暁 浜松医科大学, 医学部, 助教 (40416665)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | がんゲノム / 内在性レトロウイルス / 挿入変異 / 次世代シーケンサー / 肺がん / 胃がん / 大腸がん |
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| Outline of Annual Research Achievements |
外来性レトロウイルスのゲノム配列を起源とするヒト内在性レトロウイルス（HERV）は、ヒトゲノムの約8%を占めるレトロトランスポゾンである。HERVは、ある部位においてはその存在の有無が個体間で異なる「挿入多型」が知られている一方、体細胞における挿入変異については具体的な報告はまだない。本研究では、HERVのサブグループであるHML-2を対象に腫瘍組織内での挿入変異を検出することを試みた。これまでに、inverse-PCR法を応用した次世代シーケンサー（NGS）用ライブラリー調整を独自に開発し、複数の新規HERV挿入候補部位を肺がん、胃がんおよび大腸がん組織から同定してきた。これら同定された候補部位の精度を担保するために、機械学習を用いて擬陽性部位を除くことを試みた。本研究において実際にペアエンドリードの片側として解読される配列は、HERVの末端十数塩基とHERVに隣接する配列数十塩基が連なったものである。この配列が擬陽性である可能性を検証するため、擬陽性の場合に想定される配列を数百程度作成し、それを教師データとして機械学習を行い、実際のNGSで解読した配列の擬陽性判定に用いた。最終的に、18症例21個所のHERV挿入変異候補部位を得ることができた。これら挿入変異をゲノムPCR法で確認することを試みたが、検出するには至っていない。これは、HERVの長さが数千から一万塩基にもなること、および腫瘍組織におけるheterogeneityが関係しているのではないかと推測される。今後は、新たな検出感度の高い手法を用いるなどして、NGS解析で得られたHERV挿入変異候補部位の確認を行っていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
肺がん、胃がんおよび大腸がんの病変組織からDNAを抽出した。症例の選択にあたっては、体細胞変異またはモザイクを期待して、進行度の高いもの、もしくは比較的発症年齢が低いものを優先して選択した。これまでに35症例をinverse-PCR法をベースにしたNGSで解読した。この手法で解読される配列は、HERVの末端配列とそれに隣接する配列であり、HERVに隣接する配列がヒトゲノム上のどこに位置するかを解析することでHERV挿入部位を同定した。ヒトゲノムの40%低度が反復配列と呼ばれる特異性の低い領域であるため、HERVの隣接部位が反復配列であった場合は除外した。また、ヒトゲノム上には多数のHERV配列が存在しており、それら既存のHERV配列の末端と隣接配列についても多数検出されてきてしまうため、既存HERV部位をリスト化し、それらについてもHERV挿入変異候補部位から除外した。既存HERV部位のリスト化にあたり、挿入多型も考慮し、既報および自らの解析で新規に同定したものも加えた（論文投稿中）。新規HERV挿入多型部位はデータベースに登録した（accession number: LC154972-LC154976）。注意しなければならない点は、inverse-PCR時にHERV隣接領域内で伸長反応が止まってしまい、別の類似ゲノム領域から伸長反応が再開してしまう場合であり、その場合は擬陽性となってしまう。そのため、擬陽性だと想定される仮想配列を数百程度作成し、それらのレファレンスゲノムに対する類似配列数を求め、そこから算出される値を特徴量として機械学習の教師データとして用いた。その結果、擬陽性だと判定されたものについてはHERV挿入変異候補部位から除外し、最終的に18症例21個所のHERV挿入変異候補部位を得た。以上の経緯から概ね順調に進んでいると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでのNGS解析で同定した18症例21個所のHERV挿入変異候補部位について、今後はNGS解析以外の手法でHERV挿入変異を確認する必要がある。しかし、常法のPCR法を用いてそれら候補部位における挿入変異を検出するには至っていない。HERVが挿入されていない状態（pre-insertion）の部位をPCRで検出する場合、仮に200bpの断片が増幅されるとする。そこにHERVが挿入されたものを検出するには、200bpに加えさらにHERVの長さ（約7k~10kbp）の分の領域を増幅させないといけない。10kbpのPCR自体は難しくはないが、現時点で挿入変異を検出できていないのは、長鎖であることに加え腫瘍組織のheterogeneityとHERVが反復配列であることも要因だったのではないかと考えている。さらに状況を難しくしているのは、単にHERVが挿入していることを検出するだけではなく、挿入HERVの詳細な塩基配列を知る必要がある点である。これまでにHERV体細胞挿入変異の報告はないことから、どのようなHERV配列が体細胞挿入変異を起こし得るのかを知ることは、腫瘍のみならずゲノム異常が原因となる全ての疾患においてHERV挿入変異の可能性を考慮に入れると、必須ともいえる重要なポイントである。今後の研究の方策として、HERV末端配列とその隣接領域との境界配列を標的としたプライマーの使用によりPCR時における特異性を上げることや、超高感度およびPCR阻害効果を極力避けることを考慮に入れ、一分子PCR法などの最先端の技術を活用することを想定している。
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| Remarks |
HERVに関連するゲノム解析ツールを公開
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Research Products
(2 results)
