CRELD1欠失変異による上顎洞癌自然発症モデルマウスの確立

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K08422
• Research Institution: University of Fukui
• Principal Investigator: 西宗 敦史 福井大学, 医学部, 助教 (40311310)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 上顎癌 / 疾患モデル動物

Outline of Annual Research Achievements

上顎癌は耳鼻科領域の悪性腫瘍で副鼻腔に発生する癌としては最も多いが、症例が比較的少ないこと、適切な動物モデルの存在しないことなどから、他の悪性腫瘍に比べてその研究が遅れています。本研究課題では、CRELD1という本疾患との関連が先行研究によっては疑われていなかった遺伝子の異常で、マウスにおいて本疾患に類似した病態を引き起こすという観察から、本疾患のモデル動物の開発を試みています。
CRELD1遺伝子を染色体上で欠失させたノックアウト動物を作製し、自然突然変異によって誘発される症例の観察を行いました。遺伝子操作を行った染色体領域でCRELD1以外の遺伝子について、実験的に意図しなかった異常が起きていないことをgenomic PCR法によって解析しました。CRELD1領域の近傍にあるいくつかの遺伝子について、異常がないことを確認できたので、本実験で観察された上顎癌はCRELD1遺伝子の異常を原因として起こっていることがさらに確実となりました。従って、ヒトの実際の臨床例においても、CRELD1の遺伝子異常を検索することが今後重要になってくると考えられます。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

CRELD1欠失アレルをヘテロ接合に持つノックアウトマウスを飼育し、上顎癌発症マウスを得ているが、当初期待された発症率よりもかなり低く、実験に十分な発症個体が得られていない。このため、ヘテロ接合個体を用いた研究に関しては、発症確率を十分に上昇させるための実験を計画し、現在申請中である。（今後の研究の推進方策等を参照）当初の計画ではコンディショナルノックアウトアレルのES細胞への再導入とキメラマウスの作製を計上していたが、初年度は予算的な問題で実行を断念し延期している。ノックアウトアレルのCRELD1座位近傍の構造及び発現の解析は順調に進行しており、当初の予定通り予期しない構造的な異常が導入されていないことを確認できている。腫瘍組織は酵素活性測定を行える新鮮な生検標本が得られていないので、タンパク量の定量解析に留まっているが、カルシニューリンについて得られた結果は、カルシニューリン自体の発現低下は認められておらず、概ね予定通り進行している。

Strategy for Future Research Activity

現在継続飼育しているヘテロ接合個体に関しては、上顎癌発生頻度を上昇させることを期待して、頭部への部分エックス線照射による染色体DNA二重鎖切断刺激を与え、自然に起こっている頻度の低い野生型アレルの突然変異を誘発する実験を行う。現在の飼育環境下では、免疫学的に脆弱な状態で継続飼育することは困難であるため、免疫抑制的な発癌誘導手法は一切用いず、また骨髄抑制を誘導するエックス線の全身照射も行わない。あくまでも標的組織近傍の部分照射にとどめる。また化学発癌物質の長期投与による実験等も本研究課題の目的から外れるため、行わないものとする。Creld1-/-個体は胎生12日までに致死となるため、ヘテロ接合個体として維持する。
腫瘍発生実験に用いる個体群はゲノタイピング後雌雄別飼育し、野生型個体を陰性対照として若干数ふくめる。個体群維持に用いるグループはヘテロ接合同士の交配を行わせる。腫瘍発生実験に用いるグループは、頭部へのX線照射（1.5-2.0Gy/週×4程度を開始点とする。）を行う群を含める。上顎に腫瘍を発生した個体は、眼窩から眼球が突出してくるので、肉眼的に同定できる。解析の対象とする個体はイソフルラン過剰吸入により安楽死後、解剖し、組織学的解析に供する。