2016 Fiscal Year Research-status Report
破骨細胞分化因子受容体(RANK)発現制御機構の解析
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15K08426
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
北澤 理子 愛媛大学, 医学部附属病院, 准教授 (00273780)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原口 竜摩 愛媛大学, 医学系研究科, 講師 (00423690)
水野 洋輔 愛媛大学, 医学部附属病院, 助教 (90748021)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 破骨細胞 / RANK / 遺伝子プロモータ / 転写因子 / メチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
I) マウスRANK遺伝子の基本転写調節に関する検討- RANK遺伝子の翻訳開始部位より約200bpの付近のCpG islandメチル化による転写制御について検討した。特に細胞老化の実験モデルとして、継代数の異なるRAW cellを用いて比較検討した。高継代数のRAW細胞では継代の少ない若い細胞に比して、CpGメチル化が増加し、RANK発現と破骨細胞分化の低下を来すが、5Aza-dC処理による脱メチル化により、RANK発現の回復と破骨細胞形成、TRCAPなど関連遺伝子の発現回復を示した。
II) 新規RANK splicing variantによる破骨細胞分化制御機構-vRAN遺伝子改変動物の解析：vRANKの全身発現ではマウスの死亡率が高いため、組織特異的発現を行った。破骨細胞特異的にvRANKを発現するRANK-Cre/vRANKでは破骨細胞形成や骨量に有意の変化は認めなかった。マクロファージ～破骨細胞までに特異的なLysM-Cre/vRANKにおいて、脾臓細胞ex vivo培養での破骨細胞形成の減少と、若年成人個体での骨量増加傾向を認めた。
IV) 骨巨細胞腫におけるRANKLおよびRANK発現制御機構の解析-骨巨細胞腫の病理組織標本自体を抗原として作成したモノクローナル抗体のうち2つについて、未知の抗原を含む蛋白質を2次元電気泳動に展開して該当するspotを切り出し、抗原蛋白の質量分析を行った。LC/MS解析を行い数種類の候補分子が得られた。そこで、骨巨細胞腫に特異的な遺伝子変異ヒストンH3F3Aにより制御される分子の絞り込みを行った。
上記の成果は、日本病理学会総会、日本骨代謝学会、米国骨代謝学会ASBMRにて報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
I) マウスRANK遺伝子の基本転写調節に関する検討- 継代数の異なるRAW細胞の比較検討については、前年度のデータを補完し、確認することができた。
II) 新規RANK splicing variantによる破骨細胞分化制御機構-vRAN遺伝子改変動物を用いた機能解析については、LysM-Cre/vRANKの異なる週令数マウスの脾臓培養細胞のex vivo 破骨細胞形成実験系で、破骨細胞形成を抑制する可能性を示唆するデータを得た。
IV) 骨巨細胞腫におけるRANKLおよびRANK発現制御機構の解析-骨巨細胞腫の病理組織標本自体を抗原として作成したモノクローナル抗体のうち2つについて、LC/MS解析を進めた。骨巨細胞腫に特異的な遺伝子変異ヒストンH3F3Aにより制御される分子があり、骨巨細胞腫の腫瘍発生や組織特性に繋がる知見が期待出来る。
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| Strategy for Future Research Activity |
I) マウスRANK遺伝子の基本転写調節に関する検討- 継代数の異なるRAW細胞の比較検討で得られた知見を、週令数の異なるマウスのDNAに展開し、加齢によるRANK発現への影響を検討する。
II) 新規RANK splicing variantによる破骨細胞分化制御機構-vRAN遺伝子改変動物を用いた機能解析については、LysM-Cre/vRANKの成人個体での骨量解析をさらに進めると共に、長期飼育マウスでの骨粗鬆症への影響を検討する。
IV) 骨巨細胞腫におけるRANKLおよびRANK発現制御機構の解析-骨巨細胞腫の病理組織標本自体を抗原として作成したモノクローナル抗体で認識される組織抗原のうち、骨巨細胞腫に特異的な遺伝子変異ヒストンH3F3Aにより制御される分子を絞り込み、破骨細胞形成、RANKL-RANK経路との相互関係の有無を検討する。
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| Causes of Carryover |
vRANK遺伝子改変動物の作成については、科学研究費使用開始時期までに当初の動物を入手することができた。2年目はマクロファージ～破骨細胞特異的発現のRANK-Cre/vRANK、LysM-Cre/vRANKの2系統の飼育、維持に経費を要したが、両者の比較検討により、vRANKが 15-20%の破骨細胞抑制作用を有することを示唆する結果を得た。
所属研究室の他の経費、研究に参画する学生研究費など耗品購入の一部に充当することができて、次年度使用額が発生した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
vRANK遺伝子改変動物について、若年個体での骨量を解析したが、加齢に伴う骨減少への抑制効果の有無は検討を要する課題である。遺伝子改変動物の長期飼育には経費がかかるが、最終年度の経費を有効に活用する予定である。また成果の取りまとめを行い、学会発表や論文投稿を行う際に、有効活用する。
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