2015 Fiscal Year Research-status Report
腸管毒素原性大腸菌不活化ワクチン開発のためのトキソイド及び定着因子抗原の開発
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15K08428
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| Research Institution | University of the Ryukyus |
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Principal Investigator |
新川 武 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 教授 (50305190)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原國 哲也 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 研究員 (60593598)
玉城 志博 琉球大学, 熱帯生物圏研究センター, 研究員 (00720822)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 腸管毒素原性大腸菌（ETEC） / 易熱性腸管毒素（LT） / 耐熱性腸管毒素（STa） / サブユニットワクチン / コレラ毒素（CT） / 交叉反応性 / ５量体 / ジスルフィド結合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、腸管毒素原性大腸菌（ETEC）が産生する易熱性腸管毒素（LT）と耐熱性腸管毒素（STa）に対するタンパク質性のサブユニットワクチンの開発を進めている。特にSTaは、18～19アミノ酸残基程度の小さなペプチド断片であるため、それ自体では免疫原性を全く示さない。よって、我々は、LTのB鎖（LTB）とSTaを融合させることで、その免疫原性を向上させることを計画した。しかし、LTBは大腸菌での高発現が困難であることが分かったため、LTBと高い交叉反応性を示すコレラ毒素（CT）のB鎖（CTB）をLTBの代わりに活用することを考案した。実際、CTBは大腸菌の封入体から効率よく巻き戻り、本来の５量体を再構築できることが明らかとなった。よって、昨年我々はそれをVaccine誌で報告した（Tamaki et al., 2016)。
計画当初、STaの免疫原性を向上させる目的で、LTBとSTaを融合させたLTB-STaを考案していたが、それをCTB-STaを構築することに計画変更した。しかし、その前にSTa自体の性状解析のため、本ペプチド自体を大量に確保する必要があり、精製タグとしてZZを融合させたZZ-STa融合タンパク質を大腸菌発現させた。この融合タンパク質は、大腸菌内で可溶性発現したが、STa分子内の複雑なジスルフィド結合（S-S）は正しく形成されず、STa分子間同士でS-Sが形成されたため、融合分子自体が高分子量化されることが明らかとなった。
以上の結果を受け、平成２８年度は、STaの分子内S-Sだけを正しく形成させる方法論を確立する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究成果により、LTBよりもCTBの方が大腸菌封入体からの巻き戻し効率が格段高いことが明らかとなり、その発現・リフォールディング・精製法についての新たな知見を得たため、以下の学術論文を発表した。また、STa発現・精製に関する新たな課題にも直面したが、正しいジスルフィド結合形成法について引き続き検討しており、プロジェクト全体としてはおおむね順調に進んでいると判断した。
Tamaki Y, Harakuni T, Yamaguchi R, Miyata T, Arakawa T. Cholera toxin B
subunit pentamer reassembled from Escherichia coli inclusion bodies for use in
vaccination. Vaccine. 2016 Mar 4;34(10):1268-74.
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| Strategy for Future Research Activity |
「研究実績の概要」の項目でも記載したとおり、STa分子を天然高次構造を保った状態で、融合タンパク質として発現させる新しい方法論の確立が必要である。特にCTB分子とSTaを融合させたCTB-STaが互いに相互作用せず、独立した均一性の高い分子として５量体を形成させるノウハウが必要である。この技術の確立のためには、我々のこれまでのタンパク質リフォールディング法（Tamaki et al., 2016)にさらに新たな方法を加える必要があると考えている。
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