2016 Fiscal Year Research-status Report
新しいIL-6/IL-12ファミリーサイトカインの同定とその機能解析
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15K08433
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
徐 明利 東京医科大学, 医学部, 客員講師 (80597964)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
善本 隆之 東京医科大学, 医学部, 教授 (80202406)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | IL-27 / EBI3 / p19 / IL-23 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1) 組換え精製EBI3/p19蛋白質の作製と機能解析
(2) EBI3/p19のレセプターとシグナル伝達機構の解明
FLAGタグ付きの1本鎖マウスEBI3/p19発現プラスミドを作製し、HEK293T細胞に一過性にtransfectし上清を抗FLAG抗体カラムにかけ組換え精製EBI3/p19蛋白質を調製した。また、この蛋白質の想定されるレセプターは、gp130とIL-23Rであるので、これらとさらにIL-12Rb1およびIL-12Rb2の発現ベクターを、因子依存的に増殖するB細胞株BaF/3細胞に遺伝子導入した。このBaF/3細胞は、3H-thymidineの取り込みによりIL-12、IL-23、IL-27のいずれのサイトカイン刺激によっても濃度依存的に細胞増殖を誘導した。ところが、この組換え精製EBI3/p19蛋白質は、抗FLAG抗体によるウエスタンブロット解析によりしっかりとした目的のバンドが見られたにも関わらず、このBaF/3細胞の増殖を誘導できなかった。この細胞は、IL-35のレセプターであるgp130とIL-12Rb2を発現しているので、IL-35に反応するはずであるが、市販の組換え精製IL-35蛋白質を用いても増殖は誘導できなかった。そこで、HEK293T細胞へ遺伝子導入し、細胞溶解液を用いた免疫沈降反応により、カルネキシンは、EBI3やp19およびp35と結合したが、IL-27のp28とは結合が殆ど見られないことがわかった。以上の結果は、EBI3/p28（=IL-27）と異なり、EBI3/p19やEBI3/p35（=IL-35）は、サイトカインおよびそのレセプターサブユニットとして未同定の分子の関与が必要と考えられるが、その分子については不明のままである。そのような分子の1つとしてカルネキシンが考えられるが、未だポジティブな結果は得られていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度の、目標であった組換え精製EBI3/p19はできたが、その機能を確認するまでには至らなかったので、その点、遅れている。来年度も、この課題に取り組み、活性のある組換え精製蛋白質の作製を目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) EBI3/p19-Tgマウスを用いた生体内での役割とその作用機序
我々は、既に肝臓特異的なプロモーターを用いて発現量の異なるEBI3/p19を発現する2系統のTgマウスを作製した。発現量は、肝臓の細胞溶解液の抗FLAG抗体を用いたウエスタンブロット解析より、10倍ぐらい発現量の違いがあることがわかった。そこで、まず、コンカナバリンA投与で誘導される自己免疫性肝炎モデルを用いて、血中のトランスアミナーゼ（GOTとGPT）活性測定と肝臓の組織学的解析により肝傷害の程度を比較し、このEBI3/p19の機能を明らかにする。次にその作用機序を調べるため、血中および肝臓の単核球細胞でのIL-22やIL-23、IL-17などのサイトカイン発現を、ELISAやリアルタイムRT-PCRなどで調べる。IL-22産生の増強が見られれば、抗IL-22抗体（米国Genentech社より入手済）投与により肝炎の抑制効果がキャンセルされないか調べる。抗体投与の効果がはっきりしない場合も考慮し、IL-22欠損マウス（Genentech社より入手済）とEBI3/p19-Tgマウスを交配させてIL-22欠損EBI3/p19-Tgマウスを作製し同様に検討する。
(2) 機能的な組換え精製EBI3/p19蛋白質の作製
平成28年度の検討より、HEK293T細胞を用いて組換え精製EBI3/p19蛋白質の作製はできたが、その想定されるレセプターを強制発現したBaF/3細胞の増殖を誘導できなかった。この難問の解決には、サイトカイン自身、またはそのレセプターに不足分子があると考えられるので、その同定を試みる。
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| Causes of Carryover |
ぴったりと金額を合わせるのが難しいため、少し残額が出た。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
主に、消耗品代に使用する予定である。
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[Journal Article] Expanding diversity in molecular structures and functions of the IL-6/IL-12 heterodimeric cytokine family.2016
Author(s)
Hasegawa, H., Mizoguchi, I., Chiba, Y., Ohashi, M., Xu, M. and Yoshimoto, T.
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Journal Title
Front. Immunol.
Volume: 7 (479)
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] IL-17A-producing CD30+ Vδ1 T cells drive inflammation-induced cancer progression.2016
Author(s)
Kimura, Y., Nagai, N., Tsunekawa, N., Sato-Matsushita, M., Yoshimoto, T., Cua, D., Iwakura, Y., Yagita, H., Okada, F., Tahara, H., Saiki, I., Irimura, T. and Hayakawa, Y.
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Journal Title
Cancer Sci.
Volume: 107 (9)
Pages: 1206-1214
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Promotion of expansion and differentiation of hematopoietic stem cells by interleukin-27 into myeloid progenitors to control infection in emergency myelopoiesis.2016
Author(s)
Furusawa, J., Mizoguchi, I., Chiba, Y., Hisada, M., Kobayashi, F., Yoshida, H., Nakae, S., Tsuchida, A., Matsumoto, T., Ema, H., Mizuguchi, J., and Yoshimoto, T.
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Journal Title
PLoS Pathog.
Volume: 12 (3)
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] IL-27 induces antitumor activity by promoting differentiation of HSCs to M1-like antitumorigenic macrophages and their mobiliziation into tumor.2016
Author(s)
Chiba, Y., Mizoguchi, I., Hasegawa, H., Ohashi, M., C., Xu, M., and Yoshimoto, T.
Organizer
第45回日本免疫学会総会・学術集会
Place of Presentation
沖縄
Year and Date
2016-12-05 – 2016-12-07
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[Presentation] Promotion of expansion and differentiation of hematopoietic stem cells by IL-27 into myeloid progenitors to control infection in emergency myelopoiesis.2016
Author(s)
Yoshimoto, T., Furusawa, J., Chiba, Y., Xu, M., Hasegawa, H., Nakae, S., Kobayashi, F., Yoshida, H., and Mizoguchi, I. Ohashi, M., Hasegawa, H., and Mizoguchi, I.
Organizer
Symposium, 16th International Congress of Immunology
Place of Presentation
Melbourne, Australia
Year and Date
2016-08-21 – 2016-08-26
Int'l Joint Research
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[Presentation] Establishment of a novel in vitro evaluation system for the prediction of respiratory sensitizing potential of chemicals.2016
Author(s)
Yoshimoto, T., Ohashi, M., Hasegawa, H., Chiba, Y., Xu, M., and Mizoguchi, I.
Organizer
ICCA-LRI and NIHS Workshop
Place of Presentation
Awaji Island
Year and Date
2016-06-15 – 2016-06-16
Int'l Joint Research
