2016 Fiscal Year Research-status Report
雄性生殖体の鞭毛放出とPyGM75の構造機能相関解析
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15K08443
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
橘 真由美 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 助教 (00301325)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | マラリア原虫 / 生殖母体 / ミクロガメート / 鞭毛放出 / プロテアーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
宿主内で形成された雌雄のマラリア原虫生殖母体は吸血により蚊に摂取されると、雄は運動性を持った鞭毛（ミクロガメート）を赤血球から放出し、生殖体に分化した雌と受精する。申請者は、これまでにネズミマラリア（P.yoelii17X)を用いた研究で、雄の生殖母体から生殖体で発現する新しい分子であるPyGM75を同定し、この分子が鞭毛放出に関与するということを明らかにした。本研究では、PyGM75のアミノ酸配列に変異を入れた原虫を作出し、表現型を解析することで、その役割について詳細に解き明かすことを目的とした。
当該年度は、前年度、作出に成功したPyGM75のプロテアーゼドメインの活性部位に変異を入れた組換え原虫および、C末の膜貫通領域を欠損した組換え原虫のクローン化をまず行った。それぞれのクローン原虫を用いて、in vitroでの鞭毛放出能を検討するために、組換え原虫感染マウスから採取した血液を、鞭毛放出を誘導する培養液に加え５分間室温でインキュベートした後、血球計算盤を用いて運動性を持った原虫を数え、野生型原虫と比較した。前者の組換え原虫では、WTとほとんど差が見られなかったが、後者の組換え原虫では、若干減少傾向がみられた。また、蚊への感染性を確認するために、組換え原虫感染マウスを媒介蚊に吸血させ、10日後に蚊の中腸に原虫がいるかどうかを解剖して確認することで、鞭毛放出以降にも機能を有するかについて、現在解析を進めている。
また、PyGM75は、プロテアーゼドメインを持つことから、実際にプロテアーゼの活性を保持するかどうかを確認するために、組換えタンパク質の作製を行った。さらにプロテアーゼドメインに変異を入れた組換えタンパク質についても現在作製中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
PyGM75のプロテアーゼ活性領域のアミノ酸に変異を導入した原虫、及びC末の膜貫通領域を欠損させた原虫の表現型解析を現在進めており、これらの解析については、概ね順調に進展していると言える。一方で、立体構造の変化が鞭毛放出の機能に影響があるかどうかを確認することを目的としたシステインをアラニンに変換させた原虫の作製については、基盤となるコンストラクトのクローニングが滞っており、当初予定していた１２個各々のシステインを置換した原虫作製が遅延している。
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| Strategy for Future Research Activity |
すでに作製済みの２種の組換え原虫については、鞭毛放出、及び蚊への感染性について、引き続き表現型解析を進める。また、再現性についても検討する。他のステップにおける機能の可能性を考慮して、雄性生殖母体の形成能、及び形態の変化などについても詳細に観察する。また、作業の遅れをとっている、システインをアラニンに置換する原虫作製については、早急に基盤のコンストラクト作製を完了させる。C末の構造変化が鞭毛放出に影響をもたらすという現象が以前の実験結果から得られているので、よりC末に近いシステインを優先的に置換していくようにする。
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| Causes of Carryover |
当該年度は、すでに保有している試薬等を用いることで使用額を大幅に節約することが可能であった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
すでに作製済みの組換え原虫の解析に必要なマウス、ウェスタンブロットおよびIFAなどに必要な抗体、酵素の購入に使用する。また、これまでに完了していない組換え原虫の作製に必要な遺伝子関連試薬、プラスチック消耗品、および組換えタンパク質の合成用試薬等の購入に使用する予定である。さらに、研究成果を発表するための学会への参加費、及び旅費、論文投稿料等に使用するつもりである。
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Research Products
(1 results)
