2015 Fiscal Year Research-status Report
サルモネラのNF-κB活性化制御タンパク質群の包括的機能解析
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15K08470
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
羽田 健 北里大学, 薬学部, 講師 (00348591)
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2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | サルモネラ / III型エフェクター / NF-κB |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的はサルモネラ属細菌におけるNF-κB制御タンパク質の機能を解析し、同定した全てのNF-κB制御タンパク質群によるNF-κB制御機構および炎症制御機構をサルモネラ腸炎モデルにより実験で証明することである。平成27年度はNF-κB活性化を制御する機能をもつIII型エフェクターAとアミノ酸相同性を示すタンパク質BおよびCについて生化学的な手法を用いて機能解析を行った。
これまでの研究で研究代表者らは、サルモネラIII型エフェクターAが metalloprotease活性をもち、NF-κB subunit RelA (p65) を特異的に切断することで、NF-κBの核移行を阻害することによりNF-κB活性化を制御することを明らかにした。タンパク質BおよびCはエフェクターAと高いアミノ酸相同性（B: 99%、C: 93% Similarity）をもつことから、タンパク質BおよびCがエフェクターAと同様にNF-κB活性化を制御する機能をもつことが予想された。そこでタンパク質BおよびCをコードする遺伝子を哺乳動物発現ベクターpEGFP-C1にクローニングし、NF-κBルシフェラーゼレポータープラスミドと共にヒト子宮頸癌由来上皮細胞HeLaにco-transfectionし、レポーターアッセイを行った結果、タンパク質BをtransfectionしたHeLa細胞においてのみ、NF-κB活性化が制御されていることを見出した。またタンパク質BはIII型エフェクターAと同様にmetaroprotease活性をもち、NF-κB p65を特異的に切断することで、NF-κBの核移行を阻害することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成27年度の研究計画は（1）タンパク質BおよびCがNF-κB活性化を制御するか否かを明らかにすること、（2）これらのタンパク質がエフェクターであるか否かをあきらかにすることであった。（1）ではタンパク質BのみがNF-κB活性化を制御するという結果となり、またタンパク質Bは酵素活性および宿主の標的タンパク質もAと同様であったことから、計画どおりに解析が進んだ。一方、タンパク質Cについては、タンパク質AまたはBと異なる酵素活性の解析や宿主細胞内における標的タンパク質の同定などが新たな課題となった。
（2）ではタンパク質BおよびCがエフェクタータンパク質であるという報告が他の複数の研究グループから報告されているので、計画から除外した。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画を作成した時点では、タンパク質BまたはCの標的タンパク質を同定するために、タンパク質BまたはCをEGFPとの融合タンパク質として一過的に発現したHeLa細胞の細胞溶解液を用いて、EGFP-TRAPカラムによるプルダウン法でB-EGFPまたはC-EGFPと結合した宿主タンパク質を質量分析により解析する予定であった。しかしながら、タンパク質Cはそのアミノ酸配列内にAおよびBと同様のmetalloproteaseコンセンサス配列をもつことから、これらのタンパク質と同様の機能をもつことが予想される。そこで、宿主タンパク質の同定には上記のプルダウン法ではなくHeLa細胞の細胞溶解液をタンパク質Cと反応させた後、二次元電気泳動法により展開し、プロテアーゼによって切断されたタンパク質の断片を質量分析により解析することとした。
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| Causes of Carryover |
平成27年度研究計画（2）においてタンパク質BおよびCがエフェクターであるか否かを確認する実験を行わなかったため。
他の複数の研究グループがタンパク質BおよびCがエフェクターであると報告しているため、確認の必要がない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度未使用金は全額、平成28年度に消耗品として使用する予定である。タンパク質Cのターゲットとなる宿主タンパク質の同定に二次元電気泳動法を用いるため、泳動用ゲルおよび蛍光色素を購入する。よって平成28年度は消耗品費1123千円、国内旅費100千円、謝金100千円、その他100千円を想定している。
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