2017 Fiscal Year Annual Research Report

Investigation of serine protease involved in proteinase-activated receptor 2-mediated itch in dermatophytosis.

Research Project

Project/Area Number	15K08472
Research Institution	Teikyo University
Principal Investigator	山田剛帝京大学, 医真菌研究センター, 准教授 (80424331)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	痒み / 白癬 / 白癬菌 / プロテアーゼ / トリプシン
Outline of Annual Research Achievements	白癬における特徴的な臨床症状の１つである痒みについて、「表皮ケラチノサイトの膜に局在するProtease-activated receptor 2 (PAR-2)が、本症起因菌である白癬菌由来のトリプシン様セリンプロテアーゼによって特異的部位で切断され活性化することが痒みの発生に関与している可能性がある」との報告がなされた。本研究の目標は、PAR-2の部位特異的切断に関わる白癬菌のトリプシン様プロテアーゼを同定し、白癬で痒みが生じる機構の解明に繋げることである。これまで白癬菌からトリプシンは見出されていない。そこで、白癬菌A. vanbreuseghemiiを材料に用い、トリプシン様モチーフを手掛かりにゲノムシーケンスデータの中から遺伝子を選抜し、Pichia pastorisでの発現を試み、発現に成功した２個の組換えタンパク質AvTLSP1 (AvARB_01633)とAvTLSP2 (AvARB_00131)を中心に基質特異性を解析した。しかし、何れもトリプシン様の基質特異性を示さず、前者は疎水性アミノ酸残基のC-末端側を、後者はロイシンとチロシンの間を優先的に切断するものと示唆された。一方、カラムクロマトグラフィーによる本菌菌糸抽出液からのプロテアーゼ精製を同時に進めてきた。アフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過による精製を経た後、SDS-PAGEで確認された３本のメジャーバンドのN-末端アミノ酸配列を解析した。しかし、何れもプロテアーゼではないものと示唆された（約57kDa：グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、約27kDa：無機ジホスファターゼ、約20kDa：低純度のため同定不能）。以上の結果を踏まえ、着目すべきプロテアーゼ遺伝子の範囲を広げる、またはイオン交換クロマトグラフィー等別の方法を加え、精製レベルの改善の必要性が示唆された。