2016 Fiscal Year Research-status Report
志賀毒素の細胞内輸送を標的とした新規腸管出血性大腸菌感染症治療薬の創出
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15K08480
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| Research Institution | Doshisha University |
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Principal Investigator |
高橋 美帆 同志社大学, 生命医科学部, 助教 (00446569)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | キナーゼ基質アレイ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
結果１）
昨年度、FRA-tet以外のサイト２阻害ペプチドKGA-tet, YTA-tetが、MMA-tetとの組み合わせにより相乗的なStx1a毒性阻害効果を示すことを明らかにしたことから、KGA-tetあるいはYTA-tetをMMA-tetと同時投与した際のStx1a細胞内輸送に及ぼす影響を検討した。その結果、いずれのペプチドにおいても、MMA-tet単独投与時と比べてStx1aの細胞内輸送に大きな変化は見られなかった。
結果２）
Stx1a+FRA-tet+MMA-tetをベロ細胞に添加した場合、アクチンフィラメントの細胞膜への局在が増加していること、アクチンフィラメントと細胞膜を架橋するタンパク質ezrinの細胞膜への局在が増加していることが明らかとなった。
結果３）
Stx刺激時に活性化されるシグナル伝達分子の網羅的解析を行うため、キナーゼ基質アレイを用いた系の確立を試みた。Intavis社のスライドスポッターを用いて、セリンスレオニンキナーゼの基質ペプチド384種類をスポットしたスライドグラスを新たに作成した。Stx1a刺激した細胞の溶解液とγP32-ATPをスライドグラスに添加し１時間反応後、リン酸化された基質を検出した。その結果、ERK, p38等のMAPキナーゼ、GSK-3beta、Gタンパク質共役型受容体キナーゼ等が活性化されていることが示された。現在、反応時間等の詳細な条件検討をおこなっている。また、Tyrキナーゼ基質アレイを作成し、同様の実験を検討中である。本系が確立され次第、MMA-tetあるいはMMA-tetとFRA-tet存在下Stx1aを添加した場合の各種キナーゼの活性化状態を検討する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
実施計画１）YTA-tet、KGA-tetについて、MMA-tetを組み合わせたときのStx1a細胞内輸送の解析に時間を要した。YTA-tetあるいはKGA-tet+MMA-tet存在下Stx1aの細胞内局在性を共焦点顕微鏡で観察したところ、MMA-tet単独の場合と比べてStx1aの輸送に大きな変化がみられなかったことから、以降の詳細な検討は現在行っていない。MMA-tetとFRA-tetを組み合わせた場合のStx1a細胞内輸送について、当初計画の各種オルガネラマーカーとの局在性が一部未完了である。（当初計画の７０％完了）
実施計画２）今回キナーゼ基質アレイを作成し、Stx1a刺激により活性化されるセリンスレオニンキナーゼあるいはチロシンキナーゼの網羅的解析を試み、系の確立に時間を要した。（当初計画の５０％完了）
実施計画３）については、当初計画ではスライドグラスを用いスクリーニングを実施することとなっていたが、系の確立に時間を要している。（当初計画の３０％完了）
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| Strategy for Future Research Activity |
１）MMA-tet+FRA-tet存在下Stx1aの細胞内輸送の影響について、ライソゾーム経路、リサイクリング経路等解析を行う。
２）今回確立したキナーゼ基質アレイを用いた系により、MMA-tet+FRA-tet添加した場合の、Stx1aによるシグナル伝達分子活性化に対する影響を網羅的に解析する。
３）多価型ペプチドライブラリーとIntavis社のスライドスポッターを組み合わせたスクリーニング系の確立と並行して、従来のセルロースシート上に多価型ペプチドライブラリーをスポット合成する系を用いたスクリーニングも行い、最終的に従来の阻害ペプチドよりも結合特異性と親和性の優れた候補阻害薬群を取得する。
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