2015 Fiscal Year Research-status Report
C.perfringens特異的溶菌酵素Psmの種特異性分子機構の解明とその応用
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15K08482
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| Research Institution | Matsuyama University |
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Principal Investigator |
玉井 栄治 松山大学, 薬学部, 准教授 (40333512)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 裕美 香川大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (10313305) [Withdrawn]
成谷 宏文 香川大学, 医学部, 助教 (30452668)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 溶菌酵素 / 細菌細胞壁 / ウエルシュ菌 / デフィシル菌 / ペプチドグリカン / X線構造解析 / SH3ドメイン / 抗菌薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ウエルシュ菌のエンドライシンであるPsmは、ウエルシュ菌の細胞壁を特異的に分解し溶菌させる細胞壁分解酵素である。本研究は、Psmの種特異性の分子メカニズムを明らかにするとともに、次世代の抗菌薬としての実用化を目指したものである。我々は、Psmの種特異性のメカニズムが、結合ドメインの親和性にのみあるのではなく、触媒ドメインと結合ドメインの立体的位置関係にも起因していると考えている。そこで、本年度は、触媒ドメインと結合ドメインの間のリンカーの長さを変えた変異体や結合ドメインの数を変えた変異体を作製し、その特異性を解析した。その結果、リンカー部位の変異体では、特異性に大きな変化は見られなかったが、結合ドメインの数を変えた変異体ではその特異性に変化が現れた。このことから、増加させた結合ドメインと触媒ドメインの位置関係が種特異性に影響を及ぼしたと考えられる。今後、種特異性の変化した変異Psmの立体構造をX線構造解析により決定し、新たな知見を得るように研究を行っていく。また、他の溶菌酵素との比較を行うため、ウエルシュ菌やデフィシル菌の溶菌酵素をクローニングし、大量発現系と精製系の構築を行った。なお、そのうちの一つのウエルシュ菌オートライシンであるAcpの触媒ドメイン（AcpCD）の結晶化に成功し、Se-Metで標識したAcpCDを用いてX線構造解析により2.25オングストロームの分解能で3次元構造を決定することに成功した（現在、論文準備中）。また、その構造より触媒メカニズムを推定している。その他、デフィシル菌のオートライシンAcdに関してもさまざまな変異体を構築して大量発現系及び精製系を構築し、結晶化を行っている。また、Psmを次世代の抗菌薬として利用するためPsmの大量調製に着手した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、リンカー部位の変異体や結合ドメインの変異体の構築を行い、それらの種特異性の解析をほぼおえることができた。また、他の溶菌酵素のクローニングと大量発現系と精製系の構築も順調に進んでいる。特に、ウエルシュ菌オートライシンであるAcpの触媒ドメイン（AcpCD）の結晶化に成功し、Se-Metで標識したAcpCDを用いてX線構造解析により2.25オングストロームの分解能で3次元構造を決定することに成功した（現在論文準備中）。さらには、デフィシル菌のオートライシンAcdに関しても各種変異体の構築及び精製系の構築が終わり、現在、結晶化の条件検討を行っている段階である。
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| Strategy for Future Research Activity |
Psmに関しては、結合ドメインの数の変化により種特異性が変化した変異体の結晶構造解析を行い、触媒ドメインと追加された結合ドメインの立体的位置関係を明らかにする。さらに、リンカー部位に関しては、プロリンなどの立体構造を大きく変化させるアミノ酸を導入した変異体を作製し種特異性を解析する。なお、種得異性に変化が見られたものに関しては、結晶化を行い3次元構造解析を行う。また、Acpは、N末端に10個の結合ドメイン（SH3-3ドメイン）をもつが、今回、触媒ドメインの結晶化及び3次元構造を決定することができた。今後、触媒ドメインに近いところから1つずつ結合ドメインを増やした変異体シリーズの作製を行う。なお、現在、4個結合した変異体の作製まで終了している。今後、これらを大量精製し種特異性を明らかにするとともに結晶化を行い3次元構造を決定することにより触媒ドメインと結合ドメインの立体的位置関係を特定し、立体的位置関係が種特異性に関与するかどうかについて検討を行う予定である。また、Psmの製剤化に向けグラム単位での精製を行い、腸溶性カプセルの作製を行う。最終的には、in vivoでのPsmによる作用を検討する予定である。
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| Causes of Carryover |
4月は助成金が入金されていないため、4月分の人件費を支払うことができない。従って、次年度の4月分の人件費として繰り越しを行った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
4月分の人件費として使用する。
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