アラキドン酸カスケードによる感染性C型肝炎ウイルス粒子形成制御機構の解析

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K08495
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 土方 誠 京都大学, ウイルス研究所, 准教授 (90202275)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: TXAS / 遺伝子発現 / HCV / 感染性粒子

Outline of Annual Research Achievements

トロンボキサンA2合成酵素(TXAS)によるHCV感染性粒子産生の分子機構を明らかにするため、TXAS阻害剤Ozagrelで組換え体HCV産生細胞を処理し、total RNAを抽出し、マイクロアレイ法により、解析した。比較対照としてはOzagrel未処理細胞として、DMSOで同様に処理した同細胞を用いた。その結果、Ozagrel未処理細胞と比較して有意な変動が観察された遺伝子は認められなかった。これまでozagrel処理は処理１日目のみにozagrelを添加する方法を用いていて、感染性HCV粒子の産生の抑制が認められていたため、同様の方法でOzagrel処理した細胞の遺伝子発現を解析した。しかしながら、ozagrelの安定性を考慮して、処理３日間において毎日新たなozagrel処理をおこなう方法に変更し、同様に対照細胞に比較して発現が変動する遺伝子を、マイクロアレイより感度の高いことが」期待されるCAGE法を用いて解析した。また、ozagrelではなくsiRNAを用いてTXAS発現を抑制した細胞の遺伝子発現についても同時に解析をおこなった。その結果、TXASの活性抑制と発現抑制に共通して発現上昇あるいは低下する遺伝子群を見出すことに成功した。同定された遺伝子について、その発現のために共通した細胞内シグナルの解析をおこなったが、既存の細胞内シグナルとの関連性を見出すことができなかった。そこで各遺伝子のプロモーター領域のクローニングを行い、ルシフェラーゼの上流に挿入することで、そのプロモーター活性とTXASの関連を解析できるレポータープラスミドを作成している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

TXASによるHCV感染性粒子産生の分子機構を明らかにするため、TXAS阻害剤Ozagrelで組換え体HCV産生細胞を処理し、total RNAを抽出し、マイクロアレイ法により、解析をおこなったが、これまでozagrel処理方法を感染性粒子産生抑制効果の認められた方法でおこなった。しかしながら、その条件では、実際に解析しあた遺伝子発現様式では有意な変化が認められなかった。このことから、処理３日間において毎日新たなozagrel処理をおこなうなど、処理方法の変更やsiRNAでTXASの発現自体を低下させるなどの検討を要した。また、遺伝子発現の変動の検出法もマイクロアレイより感度の高いことが」期待されるCAGE法を用いて解析したが、解析時間に3ヶ月を要するなど非常に長かったことも遅れの原因となったと考えられる。ただし、CAGEの結果は感度高く、発現変動を示した遺伝子を同定することに成功している。

Strategy for Future Research Activity

これまでにTXASの活性抑制と発現抑制に共通して発現上昇あるいは低下する遺伝子群を見出すことに成功した。現在、同定されたそれぞれの遺伝子について、その発現のために共通した細胞内シグナルの解析をおこなったが、既存の細胞内シグナルとの関連性を見出すことができなかったため、各遺伝子の発現制御の解析を行いつつある。数種類の遺伝子プロモーター領域のクローニングを行い、それら遺伝子のプロモーター活性とTXASの関連を解析できるレポータープラスミドを作成している。これらのレポーターを用いて、TXASの抑制によって発現制御がモニターできるプロモーターを同定する。さらに、そのプロモーターの中にTXAS応答領域を同定し、その領域に結合する転写関連因子を同定し、TXASからのシグナルを解析する。また、上記遺伝子についてsiRNAによる発現低下実験をおこない、TXAS siRNAとの共処理の有無における感染性HCV産生に対する効果を解析し、TXASと感染性HCV産生を繋ぐ遺伝子を検索する。