2015 Fiscal Year Research-status Report
再構成ＲＮＰ複合体を用いたインフルエンザウイルス分節化ゲノム選択的集合機構の解明
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15K08503
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
百瀬 文隆 北里大学, 感染制御科学府, 講師 (90332204)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | インフルエンザウイルス / RNA依存性RNAポリメラーゼ / ポリシストロニック発現 / 選択的分節集合 / モデルウイルスゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、[1]インフルエンザウイルスリボヌクレオプロテイン複合体(vRNP)の人工再構成系と試験管内vRNP共沈降実験系の構築による分節集合シグナルの同定(A型)を主課題とし、[2]モデルウイルスRNA (vRNA)の競合パッケージングによる、分節集合シグナルの検証(A型)および[3] B型ウイルス選択的分節集合様式の決定(B型)を副課題としている。
[1]について、野生型vRNA配列を有する人工vRNPの再構成系を構築した。その際にウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)のポリシストロニック発現ベクターを用いることで、比較的高純度の人工vRNPが再構築可能であることを確認した。しかしこの発現系では、一部サブユニットの発現量が低下し、物理的相互作用の検証に用いる十分量の人工vRNPを調製する事が困難であった。単純な塩基置換あるいはアミノ酸変異では解消できなかったが、単独発現ベクターの共トランスフェクションによりある程度は補償可能であることを確認した。一方、当初計画ではRdRp恒常発現細胞を樹立しvRNP再構成に用いる計画であったが、ルシフェラーゼアッセイなどに必要なRdRp量は恒常的に得られるものの、やはり十分なタンパク質量を確保することが困難なため、一過性発現系を用いることにした。
[2]についてはホタルまたはウミシイタケのルシフェラーゼ遺伝子どちらかを用い、野生型・変異型の分節集合/パッケージング配列を有するモデルゲノムの構築をおこなった。現在、様々な変異モデルゲノムを用いて、競合パッケージング系の構築を行っている。
[3]についてB型インフルエンザウイルス株ゲノムのクローニングを行い、可能な限り均一な遺伝子配列を有する組換えウイルスの作成を試みたが、現時点で安定作成に成功していない。プラーク単離した野生株を用いた検出系の最適化を並行して試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
[1]インフルエンザウイルスvRNPの再構成系と試験管内vRNP共沈降実験系の構築による分節集合シグナルの同定(A型)について、vRNP再構成系の構築に成功し、現在は再構成・回収効率を可能な限り高めるための最適化を試みている。当該年度の目標はほぼ達成できた。精製した人工vRNPを用いて他分節との相互作用検証に着手したが、当初想定したような選択的分節集合を示唆する強い相互作用は現時点で確認できていない。vRNP共沈降実験系についても、必要因子の追加や共沈降条件の最適化などが必須であり、当初計画で想定したよりも困難である可能性が考えられる。
[2]モデルvRNAの競合パッケージングによる分節集合シグナルの検証(A型)については、モデルvRNAの作成が終了しており、これを用いた競合パッケージングの条件検討を進めている。概ね順調に進行中。
[3]選択的分節集合様式の決定(B型)については、おそらく手技的な問題にすぎないと思われるが、組換えB型インフルエンザウイルスの作成がうまく行かず、分節集合の検証には至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
[1]インフルエンザウイルスvRNPの人工再構成系と試験管内vRNP共沈降実験系の構築による分節集合シグナルの同定(A型)について、特定2分節vRNP同士の相互作用は想定よりもかなり弱い可能性が示唆された。一方、既知の報告によれば8分節１セットの選択的分節集合は感染細胞において効率よく行われていると考えられ、試験管内共沈降系で観察された結果とは矛盾する。精製vRNPのみで選択的集合が再現可能と考えていたが、何らかの補因子やvRNP同士の相対配置などの追加条件が必要かもしれず、そのような可能性について検討を進める。
[2]モデルvRNAの競合パッケージングによる分節集合シグナルの検証(A型)について、構築した系を用いて今後は選択的分節集合/パッケージングに必要な領域の絞り込みを行う。
[3]選択的分節集合様式の決定(B型)については、均一ゲノム配列を持つ検証対象株として組換えウイルスを作成し使用する方針を変更し、野生株をプラーク純化することで検証対象株とする予定。
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Research Products
(6 results)
