2016 Fiscal Year Research-status Report
新しい核酸医薬で敗血症を治療するための分子基盤の構築
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15K08602
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| Research Institution | Ritsumeikan University |
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Principal Investigator |
西澤 幹雄 立命館大学, 生命科学部, 教授 (40192687)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
海堀 昌樹 関西医科大学, 医学部, 准教授 (30333199)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 敗血症 / センスオリゴ / 誘導型一酸化窒素合成酵素 / 肝細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．ヒト培養細胞を用いたセンスオリゴの最適化：肝細胞由来の細胞では誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）の発現が非常に低く解析が難しかったため、iNOSの誘導的発現が認められているヒト培養細胞（DLD-1株）を用いて、前年に引き続きセンスオリゴの細胞導入実験を行った。種間で二次構造が保存されている配列をもとにしてヒト用のiNOSのセンスオリゴの配列を設計した。次にiNOSセンスオリゴを細胞に導入し、リアルタイムRT-PCR法でiNOS mRNAを定量して、iNOS mRNAに対するセンスオリゴの効果を判定した。iNOS mRNA量が最も減少する配列を決めるため、センスオリゴ配列の位置を少しずつずらしたものを作製し、細胞に導入した。その結果、iNOS mRNA量を有意に減らす配列が大体決まってきたが、もう少し再現性の確認が必要である。
２．敗血症モデル動物の遺伝子発現のパターンの解析：敗血症モデルにはガラクトサミンとLPSを投与したラット、および部分肝切除後にLPS投与したラットを用いた。投与後に肝臓を摘出してtotal RNAを抽出し、対照ラットのtotal RNAとともにマイクロアレイ解析を行い、mRNA発現量のデータが得られ、mRNA発現の比較解析を行った。代表的なmRNAについてのパターン比較を行うこともできた。
３．敗血症モデルラットでのセンスオリゴの効果の検討：平成２７年度に引き続き、ラット用のiNOSセンスオリゴの投与実験を行った。センスオリゴ投与の方法を変えて、条件の至適化を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
１．ヒト培養細胞を用いたセンスオリゴの最適化：ヒト用センスオリゴの配列の検討についてはiNOS発現が認められている培養細胞株を用いたため、最適な配列がほぼ決まった。トランスフェクション試薬についての検討は不要であったが、配列最適化にかなり時間がかかっている。センスオリゴの塩基修飾の検討はあまり進んでいない。
２．敗血症モデル動物でのセンスオリゴの効果の検討：iNOSセンスオリゴの最適化配列がわかっているものの、塩基修飾したセンスオリゴを使うため、ラットに投与するとなるとかなり高額になる。そのため１回の実験でiNOSセンスオリゴを投与するラットの匹数を多くすることができなかった。したがって、投与の方法や条件の至適化に時間がかかっている。またセンスオリゴ配列を最適化して、さらに効果を高める必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．ヒト培養細胞を用いたセンスオリゴの最適化：ヒト用のiNOSセンスオリゴの最適配列は大体わかったので、塩基修飾について検討を行う。LNAと2’-O-メチル化などについて試みる予定である。目的遺伝子以外への有害な効果（off-target効果）についても調べる。iNOSセンスオリゴがあまり効かなかった場合、細胞を使ってヒト用のTNFのセンスオリゴの最適配列や塩基修飾についても検討していく。
２．敗血症モデル動物でのセンスオリゴの効果の検討：高額な塩基修飾iNOSセンスオリゴを使うという制限があるが、致死率の改善を評価指標としてラットへの投与実験を進め、センスオリゴ配列を最適化して効果を高めていく。
３．iNOSセンスオリゴがあまり効かなかった場合、TNFセンスオリゴを敗血症モデルラットに投与することも検討する。
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Research Products
(1 results)
