酸化によるLDL粒子の硬さの分布の変化と加齢の関係

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K08607
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 武田 晴治 北海道大学, 保健科学研究院, 准教授 (80374726)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 低比重リポタンパク質 / 酸化 / 硬さ / 原子間力顕微鏡

Outline of Annual Research Achievements

低比重リポタンパク質(LDL)が酸化により硬さが柔らかくなることを既に報告している。しかし、柔らかくなるメカニズムについては判明していない。硬さが柔らかくなる一つの可能性としてLDLの構成要素の一つであるリポタンパク質の切断と断片化が考えられた。そこで、LDLをV8プロテアーゼおよびキモトリプシンで処理してリポタンパク質を切断した場合、硬さに影響があるかどうかについて検討した。
まず、酵素処理したLDLのアポタンパク質の切断状態を電気泳動により確認したところ、アポタンパク質由来のバンドが消失して、断片化したバンドが観察されたことよりアポタンパク質は切断されていることが確認できた。
一方、酵素処理前後でAFMにより硬さを測定したが、酵素処理をせずに同温度で同時間,加温したLDLの硬さと比較すると、酸化した場合のように硬さが低下することはなく、むしろ、硬くなる傾向が観察された。また、酵素処理したLDLを硫酸銅で更に金属酸化するとLDLの硬さは柔らかくなったが、酵素処理をしないLDLを酸化した場合ほど柔らかくならなかった。
このことより、酸化によりLDLが柔らかくなるメカニズムは、アポリポタンパク質の切断の影響ではないことが示唆された。
また、示差熱型カロリメーターにより酵素処理の前後でLDLの脂質の相転移温度を測定した。その結果、酵素処理により相転移温度は0.5℃から1℃程度低下することが判明した。酵素処理によりアポ蛋白質が分断化され脂質の流動性が変化したことが判明した。脂質の相転移の温度の変化と硬さの関係に相関がある可能性を示す結果が得られているが、再現性を含め詳細の検討を次年度以降に実施予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度はLDLの硬さが酸化により変化する原因を解明すること、および、高速化した測定機器の測定条件の最適化が本年度の目標であった。
高速化したAFMでは従来機より10倍以上の速さでフォースカーブの測定するため硬さへの影響が心配されたが、従来機とほぼ同様の傾向を示す結果が得られることが分かり、高速化したAFMでも測定できることが分かった。測定条件はほぼ確定した。
酸化により硬さが変化する理由としては蛋白質の分断化が原因の一つと考えていたが、その影響はないことが判明した。脂質が酸化されることによる構造の不安定化が原因かどうかについては現在検討中であるため、この部分では少し遅れている。一方で脂質の流動性と硬さおよび酸化のしやすさの関係で新しい知見が得られそうな結果が得られている。これらのことより全体としてはおおむね順調とした。

Strategy for Future Research Activity

脂質の流動性とLDLの硬さについて相関がある可能性が示唆する結果が得られている。次年度は再現性を確認するとともに、40歳から50歳台のLDLの硬さを評価するときにも脂質流動性の測定も同時に検討し、未酸化LDL、酸化LDLおよび酸化しやすいLDLと硬さの関係および脂質流動性との関係を検討していく予定である。

Causes of Carryover

サンプルを固定化するための金-mica基板を、ナノテクプラットフォームを利用して作製した。その利用料の支払い請求が年度末となり、見かけ上、残額が154634円となっているが実際は5400円の残額である。なお、5400円はナノテクプラットフォーム利用時の見積もり金額と請求金額に差額が生じたためである。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度の基板作製で使用する予定である。