2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development and clinical application of quantity profile analysis to inflammatory allied transcription factor activity by fluorescence correlation spectroscopy
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15K08612
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
北島 勲 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (50214797)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
仁井見 英樹 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 准教授 (50401865)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 転写因子 / プロファイル解析 / ＮＦ－κＢ / ＡＰ１ / DNA-転写因子結合アレイ法 / 蛍光相関分光法 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
炎症性疾患、がん、生活習慣病等は組織間、細胞間のネットワークの異常が病因となる。さらにこの異常は、細胞内シグナル伝達の異常から生じる。細胞内情報は転写因子に集約されるため、転写因子活性化を病態解析に活用する検査法開発に取り組んできた。本研究では、ELISA法による転写因子活性解析と転写因子DNAアレイ法を超えるハイスループット転写因子活性化プロファイル検査法を探索し、蛍光相関分光法（FCS法）を転写因子活性化検査法を新たに構築した。FCS法は溶液中の分子間相互作用を1分子レベルで解析でき、生体内で生じる液相反応でかつホモジニアスアッセイ（洗浄工程不要）のため迅速性が確保できる特徴があるが臨床検査領域への応用例が少ない。本研究は１）NF-κB,NF-IL6(C/EBP)、ATF(C/EBP)、SP1、AP1、NF-ATに特異的に結合できるDNAプローブを作成した。２）患者血液からカラムを用いて迅速にリンパ球を分離し高品質な核蛋白を抽出し、蛍光標識転写因子結合DNAプローブと反応させた。オリンパス社ＭＦ20測定機器を用いた2成分解析プログラムによる各転写因子リコンビナント蛋白を基準にした検量線より定量化するFCS法転写因子活性測定プロトコールを策定した。３）添加回収試験にて種々の蛋白質が存在する核抽出液中の転写因子に対して特異的に検出するにはELISA法よりFCS法が優れていることを明らかにした。４）FCS法の転写因子活性化定量法の検証は、Jurkat cellに対してTNF-α、LPS、PMA+Ionomycinで刺激2時間すると、TNF-α刺激でNF-κB活性が1.27倍、PMA+Ionomycin刺激でNF-κBが1.49倍、AP-1が1.62倍、NF-ATが1.23倍の増加を認めた。以上より、FCS法の臨床応用に向けた基盤を確立することができた。
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