2015 Fiscal Year Research-status Report
検体中の生菌数を感染症重症度や治療効果の新たな指標とする検査技術の開発
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15K08642
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
仁井見 英樹 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 准教授 (50401865)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北島 勲 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (50214797)
野手 良剛 富山大学, 大学病院, 臨床検査技師長 (60377364)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 敗血症 / 遺伝子検査 / 迅速検査 / 起炎菌の定量 / Viability PCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度、我々はViability PCRを臨床応用し、患者検体中のMRSAを高感度で検出且つ生菌・死菌の判別を行うことで、MRSAに対する抗菌薬治療の効果をモニタリングできるようにして、MRSA感染症の治療に役立つ新たな検査を構築することを目的とした。
方法ならびに成績
本研究ではmecA遺伝子を標的としたnested PCR法を工夫した。mecA遺伝子を標的とすることで、MRSEのみならず、methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE)や、methicillin-resistant Coagulase-negative Staphylococci (MRCNS)等、全てのメチシリン耐性菌を検出することが出来る。また、nested PCRを用いることで、高感度・高特異度の菌検出（LOD=8.1 CUF/mL）を行い、安定的なCt (Cycle threshold) valueが得られるようにした。更に、mecAプライマーは50サイクルまでdimerが生じないように設計し、no amplification（=死菌）を正確に確認できるようにした。
先ずViability PCRの性能評価を行うために、in vitroで抗菌薬（gentamicin, vancomycin, linezolid）のMRSAに対する効果判定を24時間、および12日間で行った。その結果、8時間後にvancomycinの感受性が確認でき、また、vancomycin投与6日目には全ての菌が死滅したことを正確に判定できた。次に臨床血液検体11検体を用い、Viability PCRの評価を行った。その結果、全てのMRSAが全て死菌である（= no amplification）と判定した検体は、培養法でもコロニーが生じなかった。但し、患者検体中（in vivo）での低濃度域のCt differenceの値は不安定であり、現プロトコールにおいて、抗菌薬の効果を定量的に判定するのは難しいことが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Viability PCRの臨床検体への応用についてはMRSAをターゲットとして検査系を構築し、実際に患者血液検体で試験運用を行った。その結果、実際の患者検体でのPMA試薬の使用は効果が不安定であり、現プロトコールではfalse-negativeの危険性が避けられないことが判明した。この点を見極めるために、今後はより検出感度を高めたプロトコールに改めて、再度の評価を行う計画である。
その他、定量検査のプロトコールは細部まで最適化を行い、生菌・死菌の判定を行わないのであれば、正確な起炎菌の定量検査が行えるところまで達成できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
メチシリン耐性菌を標的としたViability PCRの報告は今迄に無く、また、臨床検体から直接、生菌・死菌を判定するViability PCRの臨床応用も未だ報告されていないため、本研究は臨床におけるViability PCRの初の挑戦的な試みである。患者検体中の微量な菌においてはCt valueが安定しないため、現時点では菌が完全に死滅したことの判定は可能と考えるが、生菌・死菌の割合を定量的に測定するには、感度を高めるなどのプロトコールの更なる改良が必要である。
今後は「生菌・死菌の判定」と「患者検体中の起炎菌の定量測定」を2つに分けて、それぞれを異なる達成目標として研究をすすめる。起炎菌の定量測定方法は概ね確立できたので、今後は患者検体で検証していく予定である。
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Research Products
(10 results)
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[Journal Article] Antibiotic Therapy Increases the Risk of Preterm Birth in Preterm Labor without Intra-Amniotic Microbes, but may Prolong the Gestation Period in Preterm Labor with Microbes, Evaluated by Rapid and High-Sensitive PCR System2016
Author(s)
Yoneda S, Shiozaki A, Yoneda N, Ito M, Shima T, Fukuda K, Ueno T, Niimi H, Kitajima I, Kigawa M, Saito S
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Journal Title
American Journal of Reproductive Immunology
Volume: 75(4)
Pages: 440-50
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Melting Temperature Mapping Method: A Novel Method for Rapid Identification of Unknown Pathogenic Microorganisms within Three Hours of Sample Collection2015
Author(s)
Niimi H, Ueno T, Hayashi S, Abe A, Tsurue T, Mori M, Tabata H, Minami H, Goto M, Akiyama M, Yamamoto Y, Saito S and Kitajima I
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 5 12543
Pages: １－１３
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Polymicrobial Amniotic Fluid Infection with Mycoplasma/Ureaplasma and Other Bacteria Induces Severe Intra-Amniotic Inflammation Associated with Poor Perinatal Prognosis in Preterm Labor2015
Author(s)
Yoneda N, Yoneda S, Niimi H, Ueno T, Hayashi S, Ito M, Shiozaki A, Urushiyama D, Hata K, Suda W, Hattori M, Kigawa M, Kitajima I, Saito S.
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Journal Title
American Journal of Reproductive Immunology
Volume: 75(2)
Pages: 112-25
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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