2016 Fiscal Year Research-status Report
検体中の生菌数を感染症重症度や治療効果の新たな指標とする検査技術の開発
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15K08642
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
仁井見 英樹 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 准教授 (50401865)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北島 勲 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (50214797)
野手 良剛 富山大学, 附属病院, 臨床検査技師長 (60377364)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 敗血症 / 遺伝子検査 / 迅速検査 / 起炎菌の定量 / Viability PCR |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度の進歩状況としては、敗血症患者血液中の菌数測定を可能とする方法を開発し、得られた菌数と従来のバイオマーカーとを比較して、その実用性を評価した。本研究は2016年度のAMED産学連携医療イノベーション創出プログラムにも採択された。
菌数を正確に測定するため、eukaryote-made thermostable DNA polymeraseを用いたbacterial DNA contamination-free PCRと、Tm mapping法の2つの技術を用いた。起炎菌同定(Tm mapping法)と定量とは同時並行で行う。定量結果はコントロールとして用いた大腸菌としての菌数となるが、Tm mapping法で同時に起炎菌が同定されるので、この起炎菌の16S ribosomal RNAのコピー数で菌数を補正する。その結果、採血後3時間半程度で起炎菌の同定と定量結果とが同時に得られた。
実際に、敗血症患者5名の治療前、治療後24、72時間の菌数の推移を調べた。その結果、感受性の高い抗菌薬を使用した場合、24時間後に菌数は劇的に減少し、72時間後には更に減少した。それと同時に敗血症の病態の改善をみた。一方で、他のバイオマーカーは菌数の減少とは逆に上昇することもあり、必ずしも菌数の推移と一致しなかった。
今年度の研究の結果、我々は敗血症起炎菌を3.5時間以内に同定・定量する技術を開発した。本方法では抗生物質により短時間・劇的に減少する血中菌量を定量することができ、治療効果をリアルタイムに知ることができることが判明した。本方法を発展させることにより、抗生物質の適正使用の早期判断に貢献できる可能性がある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
一昨年度はViability PCRの臨床検体への応用について、MRSAをターゲットとして検査系を構築し、実際に患者血液検体で試験運用を行った。
今年度は敗血症起炎菌を3.5時間以内に同定・定量する技術を開発し、実際に、敗血症患者5名の治療前、治療後24、72時間の菌数の推移を調べた。その結果、抗生物質により短時間・劇的に減少する血中菌量を定量することができ、治療効果をリアルタイムに知ることができることが判明した。
以上、本研究課題の進歩状況はおおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究開発課題である血液中の細菌数の定量検査法はプロトコールの最適化を終え、現在特許申請を準備中である。本研究は昨年末にAMEDに採択され、今年度より富山大学付属病院での１０００検体の本格運用が開始できるように、専用機器（real-time PCR機器２台、クリーンベンチ３台、遠心機２台、他）、試薬類、マンパワー（専任の研究補助員を２人雇用）を準備した。
新たな技術開発としては、血液中の細菌数を正確に定量するため、bacterial DNA contamination-freeの真空採血管を企業と共同開発した。現在、１万本を作成し、今後の学内運用で使用すると共に、共同研究機関に配布する計画である。
また、Tm mapping法（敗血症起炎菌迅速同定法）および起炎菌迅速定量法が同時に行えるキットを三井化学株式会社と共に作成し、３月中に３００キットを導入した。現在、キットの最終動作確認と研究補助員のトレーニングを行っている。今年中旬には更に７００キットを作成・導入し、計１０００検体の学内本格運用を行う計画である。それと同時に今年５月に本検査法を先進医療に申請する予定であり、できる限り早い時期での先進医療の取得を目指している。
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