2017 Fiscal Year Research-status Report
新規疼痛抑制ペプチドのラット神経系からの単離精製とそのバイオアッセイ法の確立
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15K08676
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
池田 哲也 宮崎大学, 医学部, 准教授 (20264369)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安部 博史 北海道医療大学, 心理科学部, 教授 (20344848)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 慢性疼痛 / 糖尿病性疼痛 / 神経因性疼痛 / APGWamide / アロディニア / 神経ペプチド / HPLC / 疼痛 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的はAPGWamide様の抗アロディニア活性を有する新規神経ペプチドをラット神経系から単離精製することであり、27～28年度で、効率よく単離精製するための精製法とバイオアッセイの法を確立することができた。予備実験としてマウス1000頭分の脳組織をホモジナイズし、遠心分離機で遠沈した後、上清を集め、ロータリーエバポレーターで濃縮した。濃縮液をセファデックスでゲル濾過し分子量で分画した後、活性のあった画分をセップパックC18で前処理し、逆相HPLCで分画した。それぞれの精製段階の画分から一部を取り出し、バイオアッセイに用いた。バイオアッセイはポリエチレン製のカテーテルを髄腔内に留置した糖尿病性神経因性疼痛モデルラットを用いた。von Frey フィラメントによる足底への機械刺激に対する回避行動の閾値を指標にしてカテーテルからマウス脳抽出液の各精製段階の画分を投与し、抗アロディニア活性を調べた。逆相HPLC、陽イオン交換HPLC数段階を経て、最終精製まで進めることができた。残念ながら最終精製物の量が非常に少なく、構造決定までは至らなかったが、①糖尿病性神経因性疼痛モデルラットを用いたバイオアッセイ法で各精製過程の抗アロディニア活性を判定することが可能であることが示された。また②この精製法で脳組織から抗アロディに活性を示す物質が単離精製できることが示された。
予備実験からマウスやラットの脳からの抽出には大量の動物が必要だと思われたので、29年度は、比較的簡単に大量に集めることができるニワトリの脳から抗アロディニア活性を示す物質の単離精製を試みた。マウスの場合と同様の方法で活性物質を単離精製することができたが、構造決定までは至っていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
27-28年度は実験計画にしたがって、ラット脳組織からの抗アロディニア活性持ったAPGWamide様神経ペプチドの精製法の確立とバイオアッセイ法の確立を目標に①糖尿病性神経因性疼痛モデルラットの作製。②マウス脳組織から神経ペプチドの抽出（精製法の確立）。③抗アロディニア活性の検定 (バイオアッセイ法の確立)を行った。
糖尿病性疼痛モデルラットの作製は体重約300gのSD系雄ラットを用いた。髄腔内投与のため、ポリエチレン製のチューブでカテーテルを作り、大槽からクモ膜下腔に挿入し、先端を腰髄の髄腔内に留置した。続いて、ラットの尾静脈からストレプトゾトシン (STZ)を投与することによって膵臓のβ細胞を破壊し、糖尿病モデルを作製した。von Frey フィラメントによる足底への機械刺激に対する回避行動の閾値を測定することによって、アロディニアの程度を数値化した。予備実験としてマウス1000頭分の脳組織からAPGWamide様神経ペプチドの単離精製を試みた。セファデックスによるゲル濾過、セップパックC18、逆相HPLC、陽イオン交換HPLC数段階を経て、単一の紫外吸収ピークを示す最終精製物を得ることができたが、絶対量があまりにも少なく構造決定までは至らなかった。2年間の経験から当初の予定の100匹分のラットの脳組織では最終的な構造決定に供する量の精製物を得ることは困難と考えられた。
29年度は、大量に入手することが可能なニワトリの脳組織から抗アロディニア活性を示すAPGWa様神経ペプチドの単離を試み、数段階のHPLCによる精製過程を経て、抗アロディニア活性を示す最終精製物を得ることができたが、研究代表者の移動に伴い、研究が予定通り進行せず、構造決定まで至らなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究代表者の移動に伴い所属研究機関を変更した為、研究が予定通り進行せず、研究を１年間延長した。今年度（30年度）はニワトリの脳組織から単離精製した抗アロディニア活性を示すAPGWa様神経ペプチドの構造決定を推進する。構造決定は神経ペプチドであることを想定して、アミノ酸分析、アミノ酸配列分析、質量分析を行うのがセオリーであるが、最終精製物の紫外吸収の特性から非ペプチド性の物質であることも考えられる。したがって、まず最初にタンデムマス（MS-MS）質量分析による精密な質量分析を行うことにした。この結果を基に、ペプチドならばアミノ酸分析、アミノ酸配列分析を、非ペプチド性活性物質であるならば、さらにNMRによる構造分析を進めていく予定である。いずれにしても、分析の為にはさらなる精製物が必要なのでもう１度ニワトリ脳から前述のように、ゲル濾過、セップパック、HPLC数段階を経て、糖尿病性神経因性疼痛モデルラットをバイオアッセイに用いてに抗アロディニア活性を示す同じ生理活性物質単離精製する必要がある。
決定された構造に基づいて、人工的に合成し、ニワトリから単離した最終精製物と比較し、構造を確定する。次に、糖尿病性神経因性疼痛モデルラットのみならず様々な疼痛モデルラットを用いて、その新規抗アロディニア活性物質の活性を調べ、生体内で果たしている生理的な機能を解明していく。
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| Causes of Carryover |
研究代表者の所属研究機関の変更に伴い、29年度の研究が予定通り進行しないことが予想された為、研究期間を１年間延長した。結果としてラット購入の予算等に余剰金が生じた。この余剰金を余剰繰越金として次年度使用額に算入した。
次年度使用額はバイオアッセイ用のラットの購入費、ニワトリ脳組織の単離費用、また、最終精製物の構造分析やその結果に基づく化合物の合成に必要な費用に割り当てる予定である。
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Research Products
(1 results)
