2017 Fiscal Year Research-status Report
芽胞形成・毒素産生環境の制御に焦点をあてたウェルシュ菌食中毒予防に関する基礎研究
| Project/Area Number |
15K08783
|
|---|
| Research Institution | Osaka Prefecture University |
|---|
Principal Investigator |
安木 真世 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (40589008)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | Clostridium perfringens / 食中毒 / 芽胞形成 / 胆汁酸 / 酵母２ハイブリッド法 / ランダムミュータジェネシス |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
胆汁酸による芽胞形成の促進に関与する菌体因子の研究において、マイクロアレイによる候補遺伝子のうち、phosphotransbutylyrase遺伝子のシングルコピー補完株用のプラスミドを作製した。現在補完株を作製中である。ヒスチジンキナーゼ遺伝子に関しては当初欠損株を用いた芽胞形成の評価を予定していた。しかし他細菌属（バシラス属）では３つのヒスチジンキナーゼが協調的にSpo0Aに働いていることから１遺伝子欠損株による評価の困難さが示唆された。そこで酵母２ハイブリッド法を用いてSpo0Aとヒスチジンキナーゼの相互作用の有無を確認することで、ヒスチジンキナーゼ遺伝子の胆汁酸依存性芽胞形成への関与を評価することとした。ウェルシュ菌の酵母２ハイブリッド法は研究協力者である広島大学の成谷宏文先生が確立しており、プラスミドの分与を受けた。baitタンパク質としてSpo0Aのレシーバードメインを、prayタンパク質として９個のオーファンヒスチジンキナーゼを選択した。baitタンパク質のプラスミドは作製済であり、prayタンパク質の作製ならびに酵母２ハイブリッド法を用いた評価を現在行っている。
ランダムミュータジェネシスに関しては当初「検体調整から次世代シーケンス」は一度の実験を予定していたが、実験の正確性を上げるため再度行った。既に２回の次世代シーケンスならびに結果の統合は終了している。現在、胆汁酸依存性芽胞形成に関与し得る候補遺伝子の選定に向け結果を解析中である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
遅れている最大の原因はランダムミュータジェネシスによるものである。当初「検体調整から次世代シーケンス」は一度の実験を予定していたが、本手法はウェルシュ菌では初めての試みであることから、実験の正確性を上げるため上記実験を再度行うことを決定した。それに伴い以降の実験に遅れが生じ、本事業の期間延長手続きを行った。現在までに２度目の次世代シーケンスならびに結果の統合は終了しており、今後は当初の予定通り候補遺伝子の選択ならびに変異株を用いた解析を行う予定である。また、ヒスチジンキナーゼ遺伝子の芽胞形成への関与の評価に関して、実験手法を当初予定していた変異株作製から酵母２ハイブリッド法に変更した。変更による研究の遅れが懸念されたが、酵母２ハイブリッド法が本菌で既に確立済であったことから、速やかに実験実施に向けた環境を整えることができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
胆汁酸に関する研究では、当初の予定通りマイクロアレイにより選択された候補遺伝子に加え、次世代シーケンスの結果から芽胞形成に関連する候補遺伝子を選定し、欠損株・補完株を作製し評価を行う。ヒスチジンキナーゼ遺伝子に関しては、まず酵母２ハイブリッド法によりSpo0Aとの相互関係の有無を評価する。その上で候補遺伝子が絞られた場合、それ（ら）の変異株・補完株を作製し、芽胞形成への関与を評価する。
|
| Causes of Carryover |
胆汁酸によるウェルシュ菌芽胞形成の促進に関与する菌体因子の研究において、ランダムミュータジェネシス法を採用し、次世代シーケンスにて候補遺伝子の選択を行っている。当初「検体調整から次世代シーケンス」は一度の実験を予定していたが、本手法はウェルシュ菌では初めての試みであることから、実験の正確性を上げるため上記実験を再度行うことを決定した。それに伴い以降の実験に遅れが生じ、本事業の期間延長手続きを行った。生じた次年度使用額は当初の予定通り、次世代シーケンスの結果選定された候補遺伝子の芽胞形成への関与を分子生物学的に評価するための消耗品費として計上する。
|
Research Products
(9 results)
