深部静脈血栓形成におけるオートファジーのメカニズムの解明とその法医学への応用

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K08880
• Research Institution: Wakayama Medical University
• Principal Investigator: 野坂 みずほ 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (00244731)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 近藤 稔和 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (70251923) ; 木村 章彦 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (60136611) ; 石田 裕子 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (10364077)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 深部静脈血栓症 / オートファジー / サイトカイン / マクロファージ

Outline of Annual Research Achievements

わが国における肺血栓塞栓症の発症数は増加の一途であり，臨床医学においてのみならず，法医学分野においても，血栓の形成・溶解の機序についてのさらなる解明が望まれる．その一端として，血栓陳旧度にともなう分子機構の動態として，血栓中のCCR5の役割と，細胞内のタンパク質分解経路のひとつであり，さまざまな疾患に関与しているオートファジーの発現・動態について，主として免疫組織学的手法を用いて解明した．今後はさらに血栓中のオートファジーの分子メカニズムとその機能を解明し，法医学分野への応用を目指す包括的研究を行う．
本研究課題は，下大静脈結紮による深部静脈血栓塞栓症モデル（マウス）を用いた基礎的データの収集および陳旧度に伴う血栓内のオートファジーの病態生理学的役割とメカニズムの解析と，それに基づいた剖検例への応用の可能性についての検討から成るものである．
下大静脈結紮による深部静脈血栓症モデルを作成する．下大静脈結紮後1～21日目に安楽死させ，血栓を含む下大静脈部を採取する．これらの下大静脈は10％ホルマリンにより固定し，パラフィン包埋切片を作成した．
血栓内における陳旧度にともなう分子機構の動態としてはCCL3/CCR5とCCL5/CCR5 axisの欠損が，それぞれuPAとtPA発現を抑制することによって血栓溶解を阻害すると考えられ，CCR5は，DVT治療の有用な分子標的となり得ることが示唆された．さらに血栓形成および溶解過程において，現在最も研究が進んでいるオートファゴソームのマーカーであるLC3については，すでに免疫組織化学的検索を行った．今後はLC3に結合して選択的分解されるタンパク質であるp62/SQSTM1の動態についても，明らかにする．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究課題は，下大静脈結紮による深部静脈血栓塞栓症モデル（マウス）を用いた基礎的データの収集および陳旧度に伴う血栓内のオートファジーの病態生理学的役割とメカニズムの解析と，それに基づいた剖検例への応用の可能性についての検討から成るものである．
前者については下大静脈結紮による深部静脈血栓症モデルはすでに確立しており，下大静脈結紮後1～21日目に安楽死させ，血栓を含む下大静脈部を採取することにより血栓陳旧度別のパラフィン包埋組織標本を得ることが可能となっている．
現在までに，血栓内における陳旧度にともなう分子機構の動態としては，野生型マウスとCCR5ノックアウトマウスの血栓を比較検討することにより，CCR5が血栓溶解に関わっていることを明らかにした．さらに遺伝子解析やマウスから採取した腹腔内マクロファージを用いたin vitro実験により，CCL3/CCR5とCCL5/CCR5 axisの欠損が，それぞれuPAとtPA発現を抑制することによって血栓溶解を阻害することが判明した．さらに血栓形成および溶解過程において，現在最も研究が進んでいるオートファゴソームのマーカーであるLC3については，すでに免疫組織化学的検索を行い，血栓陳旧度に伴う変動を明らかにしつつある．今後はLC3に結合して選択的分解されるタンパク質であるp62/SQSTM1の動態についても，明らかにする．

Strategy for Future Research Activity

高齢者の増加や，食生活の変化をはじめ，深部静脈血栓塞栓症（DVT）を惹起する要因は今後も増え続けることが予想される．さらに最近でも災害被災地において，避難中の住民がDVTが原因で死亡する例が相次いで報告されている．それゆえ本研究課題は，DVTの予防とより安全な治療法の確立といった，法医学分野に限らず臨床医学分野においても，喫緊の課題を包括していると言える．そこで今後は次の点に重点を置いて研究を推進する．
血栓内陳旧度にともなう血栓中の分子機構の動態の一部については，すでに，好中球，マクロファージ，IFN-gamma，TNF-alpha，TNR-receptor type 1，IL-6，CCR5等で明らかにしてきた．マクロファージとマクロファージにより産生される細胞との関連性も明らかにしているところである．今後さらに血栓形成および溶解過程において，オートファジーに関与する分子の免疫組織化学的検索ならびに遺伝子発現の解析，タンパク質発現の解析により明らかにすることを目指す．現在最も研究が進んでいるオートファゴソームのマーカーであるLC3については，すでに免疫組織化学的検索結果を得ており，LC3の動態が血栓陳旧度判定の指標のひとつとして有用であることが示唆された．今後はLC3に結合して選択的分解されるタンパク質であるp62/SQSTM1の動態についても，明らかにする．
以上，基礎的研究結果に基づいて，血栓形成および溶解過程におけるオートファジーの動態を解明することにより法医実務的研究へと発展させる．

Research Products

• [Journal Article] Exaggerated arsenic nephrotoxicity in female mice through estrogen-dependent impairments in the autophagic flux. (2016)
  • Author(s): Kimura A, Ishida Y, Nosaka M, Kuninaka Y, Hama M, Kawaguchi T, Sakamoto S, Shinozaki K, Iwahashi Y, Takayasu T, Kondo T.
  • Journal Title: Toxicology. Volume: 339 Pages: 9-18
  • DOI: 10.1016/j.tox.2015.11.005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Immunohistochemical detection of intrathrombotic IL-6 and its application to thrombus age estimation. (2015)
  • Author(s): Nosaka M, Ishida Y, Kimura A, Hama M, Kawaguchi T, Yamamoto H, Kuninaka Y, Shimada E, Kondo T.
  • Journal Title: Int J Legal Med. Volume: 129(5) Pages: 1021-1025
  • DOI: 10.1007/s00414-015-1147-9
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Autophagy in skin wounds: a novel marker for vital reactions. (2015)
  • Author(s): Kimura A, Ishida Y, Nosaka M, Shiraki M, Hama M, Kawaguchi T, Kuninaka Y, Shimada E, Yamamoto H, Takayasu T, Kondo T.
  • Journal Title: Int J Legal Med. Volume: 129(3) Pages: 537-541
  • DOI: 10.1007/s00414-015-1168-4
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Immunohistochemical analysis on MMP-2 and MMP-9 for wound age determination. (2015)
  • Author(s): Ishida Y, Kuninaka Y, Nosaka M, Kimura A, Kawaguchi T, Hama M, Sakamoto S, Shinozaki K, Eisenmenger W, Kondo T.
  • Journal Title: Int J Legal Med. Volume: 129(5) Pages: 1043-1048
  • DOI: DOI 10.1007/s00414-015-1167-5
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Detection of endothelial progenitor cells in human skin wounds and its application for wound age determination. (2015)
  • Author(s): Ishida Y, Kimura A, Nosaka M, Kuninaka Y, Shimada E, Yamamoto H, Nishiyama K, Inaka S, Takayasu T, Eisenmenger W, Kondo T.
  • Journal Title: Int J Legal Med. Volume: 129(5) Pages: 1049-54
  • DOI: 10.1007/s00414-015-1181-7
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] AG490, a Jak2 inhibitor, suppressed the progression of murine ovarian cancer. (2015)
  • Author(s): Kobayashi A, Tanizaki Y, Kimura A, Ishida Y, Nosaka M, Toujima S, Kuninaka Y, Minami S, Ino K, Kondo T.
  • Journal Title: Eur. J. Pharmacol. Volume: 766 Pages: 63-75
  • DOI: 10.1016/j.ejphar.2015.09.039
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] ニフェジピン誤飲による中毒死の1剖検例 (2016)
  • Author(s): 山本寛記，高安達典，木村章彦，野坂みずほ，石田裕子，川口敬士，近藤稔和
  • Organizer: 第36回日本中毒学会西日本地方会
  • Place of Presentation: 国立病院機構大阪医療センター（大阪府大阪市）
  • Year and Date: 2016-02-06
• [Presentation] 深部静脈血栓症モデルにおけるCCR5システムの病態生理学的役割の解明 (2015)
  • Author(s): 野坂みずほ，石田裕子，木村章彦，國中由美，近藤稔和
  • Organizer: 第45回日本創傷治癒学会
  • Place of Presentation: JPタワーホール＆カンファレンス：JPタワー・KITTE （東京都千代田区）
  • Year and Date: 2015-11-30
• [Presentation] 皮膚創傷治癒におけるautophagyの役割 (2015)
  • Author(s): 木村章彦，石田裕子，野坂みずほ，國中由美，近藤稔和
  • Organizer: 第45回日本創傷治癒学会
  • Place of Presentation: JPタワーホール＆カンファレンス：JPタワー・KITTE （東京都千代田区）
  • Year and Date: 2015-11-30
• [Presentation] Absence of CCR5 axis accelerates thrombus formation through reduced uPA and tPA expression in mice (2015)
  • Author(s): Nosaka M, Ishida Y, Kimura A, Kuninaka Y, Mukaida N, Kondo T
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18
• [Presentation] Absence of CCR5 exaggerated pressure overload-induced heart failure (2015)
  • Author(s): Kimura A, Ishida Y, Nosaka M, Kuninaka Y, Mukaida N, Kondo T
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18
• [Presentation] Pivotal roles of CCR5 for the tumor progression in a mouse ovarian cancer (2015)
  • Author(s): Ishida Y, Kobayashi A, Sasaki S, Kimura A, Nosaka M, Kuninaka Y, Mukaida N, Kondo T
  • Organizer: 第44回日本免疫学会学術集会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道札幌市）
  • Year and Date: 2015-11-18
• [Presentation] ケモカイン受容体CCR5を介したシグナルは圧負荷による心肥大において保護的に機能する (2015)
  • Author(s): 木村章彦，石田裕子，野坂みずほ，國中由美，川口真理子，近藤稔和
  • Organizer: 第62回日本法医学会学術近畿地方集会
  • Place of Presentation: 京都教育文化センター（京都府京都市）
  • Year and Date: 2015-11-14
• [Presentation] Absence of CCR5 exaggerated pressure overload-induced heart failure in mice (2015)
  • Author(s): Kimura A, Ishida Y, Nosaka M, Kuninaka Y, Mukaida N, Kondo T
  • Organizer: Cytokines 2015 －Symphonies in Health and Disease
  • Place of Presentation: Konzert- und Kongresshalle Bamberg, Bamberg (Germany)
  • Year and Date: 2015-10-12
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Absence of IL-6 impairs thrombus resolution through reduced MMPs and uPA expression in murine deep vein thrombosis model (2015)
  • Author(s): Nosaka M, Ishida Y, Kimura A, Kuninaka Y, Mukaida N, Kondo T
  • Organizer: Society of Leukocyte Biology
  • Place of Presentation: Hilton North Raleigh, Midtown, NC (USA)
  • Year and Date: 2015-09-29
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Forensic diagnosis of compression based on expression of aquaporin-3 but not aquaporin-1 in human neck skin (2015)
  • Author(s): Sakamoto S, Ishida Y, Kimura A, Nosaka M, Kuninaka Y, Kawaguchi M, Hama M, Kawaguchi T, Kondo T
  • Organizer: 94.Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft fur Rechtsmedizin
  • Place of Presentation: Leipzig (Germany)
  • Year and Date: 2015-09-16
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ウォータージェットによる致死的損傷例 (2015)
  • Author(s): 近藤稔和，岩橋優美，川口敬士，濵 瑞貴，島田栄美，山本寛記，吉良英知，川口真理子，國中由美，野坂みずほ，石田裕子，木村章彦
  • Organizer: 第22回法医病理夏期セミナー
  • Place of Presentation: 岩手大学（岩手県盛岡市）
  • Year and Date: 2015-09-04
• [Presentation] 深部静脈血栓モデルにおけるIL-6の病態生理学的役割 (2015)
  • Author(s): 野坂みずほ，石田裕子，木村章彦，向田直史，近藤稔和
  • Organizer: 第36回日本炎症・再生医学会
  • Place of Presentation: 虎ノ門ヒルズフォーラム（東京都港区）
  • Year and Date: 2015-07-21
• [Presentation] IFN-γは１型心腎連関において保護的に機能する (2015)
  • Author(s): 木村章彦，石田裕子，野坂みずほ，向田直史，近藤稔和
  • Organizer: 第36回日本炎症・再生医学会
  • Place of Presentation: 虎ノ門ヒルズフォーラム（東京都港区）
  • Year and Date: 2015-07-21
• [Presentation] Immunohistochemical analysis on MMP-2 and MMP-9 for wound age determination (2015)
  • Author(s): 石田裕子，國中由美，野坂みずほ，木村章彦，川口敬士，濵瑞貴，坂本翔一，篠崎浩平，Wolfgang Eisenmenger，近藤稔和
  • Organizer: 第99次日本法医学会学術全国集会
  • Place of Presentation: 高知市文化プラザ かるぽーと（高知県高知市）
  • Year and Date: 2015-06-12
• [Presentation] Lack of IFN-γ exaggerates ANG II-induced aortic dissection (2015)
  • Author(s): 木村章彦，石田裕子，野坂みずほ，川口敬士，濵瑞貴，山本寛記，近藤稔和
  • Organizer: 第99次日本法医学会学術全国集会
  • Place of Presentation: 高知市文化プラザ かるぽーと（高知県高知市）
  • Year and Date: 2015-06-12
• [Presentation] 深部静脈血栓症における骨髄由来fibrocyteの動態と法医診断学的応用に関する研究 (2015)
  • Author(s): 野坂みずほ，石田裕子，木村章彦，川口敬士，濵瑞貴，篠崎浩平，坂本翔一，國中由美，川口真理子，近藤稔和．深部静脈血栓症における骨髄由来fibrocyteの動態と法医診断学的応用に関する研究
  • Organizer: 第99次日本法医学会学術全国集会
  • Place of Presentation: 高知市文化プラザ かるぽーと（高知県高知市）
  • Year and Date: 2015-06-11
• [Presentation] フェニトロチオンを含む2種の農薬を同時に検出した3事例 (2015)
  • Author(s): 高安達典，石田裕子，野坂みずほ，川口真理子，國中由美，山本寛記，木村章彦，近藤稔和
  • Organizer: 第99次日本法医学会学術全国集会
  • Place of Presentation: 高知市文化プラザ かるぽーと（高知県高知市）
  • Year and Date: 2015-06-11
• [Presentation] 皮膚から読み取る法医学 (2015)
  • Author(s): 近藤稔和
  • Organizer: 第114回日本皮膚科学会総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2015-05-30
  • Invited
• [Presentation] 法医診断における分子病理学の応用 (2015)
  • Author(s): 近藤稔和
  • Organizer: 公開ワークショップ 法医鑑定・死因究明のための新しい概念と技術－死から命を学ぶ－
  • Place of Presentation: 大阪市
  • Year and Date: 2015-05-02