2015 Fiscal Year Research-status Report
誤嚥による肺の異物反応が嚥下性肺疾患や炎症性肺疾患に及ぼす病態上の意義
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15K08899
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
山口 泰弘 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (60376473)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
栗原 由紀子 東京大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (80345040)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 誤嚥性肺炎 / 異物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
肺内の食塊に対する異物反応は、嚥下性肺炎の病理学的診断の根拠となり、衰弱した高齢者にしばしばみられる。しかし、肺の異物反応が生体に及ぼす影響は検討されていない。
我々は、食塊の代表的な異物としてセルロースを用いた新しい誤嚥のマウスモデルを作製し、肺内の異物反応とその全身への影響を明らかにするための実験を実施した。まず、粒子径 0.02 mmのセルロースパウダーをPBSに100mg/mlおよび10mg/mlになるように懸濁し、オートクレーブ滅菌したものを用意した。ケタミンとキシラジンの腹腔内投与にて深麻酔したマウスの気管切開を施行し、0.1mg/g BWおよび 0.01mg/g BW のセルロースを経気管的にC57BL/6jマウス肺内に投与した。まず、各濃度のセルロースおよびコントロールとしてのPBS投与5時間後, 24時間後, 7日後に気管支肺胞洗浄液 (BALF) 中の細胞数と細胞分画を評価した。その結果、0.1mg/g BW の投与により、24時間後のBALF中細胞数および好中球数は顕著に上昇し、７日後には、特に好中球数はコントロールと同じレベルとなった。また、同時に肺を摘出し、25 cmH2Oの一定圧で伸展固定した肺の組織像を評価した。ファンギーフローラ染色にてセルロースの気管支、細気管支、肺胞腔内への沈着を確認できた。7日後には、細気管支に沈着したセルロースを類上皮細胞が囲み、器質化肺炎の像を呈している部分も観察された。続いて、セルロース投与と同時、もしくは２４時間後、７日後、３０日後に黄色ブドウ球菌を経気管的に肺内に接種し黄色ブドウ球菌性肺炎モデルを作成し、それぞれ２４時間後に肺内の菌数を評価したところ、３０日後の群を除いて、セルロースによる異物誤嚥のあるマウスで、残存する菌数が有意に多かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では、初年度にサイトカイン動態の解析を終了する予定であったが、細菌感染モデルでの実験を優先させたため、サイトカイン動態の解析は、現在、進行中である。一方で、次年度に予定していた、持続する異物反応が感染防御能に与える影響に関する解析をほぼ終了しえたので、全体として、ほぼ当初の計画通りに進展しているといえる。
セルロースパウダーを用いた、食塊の誤嚥のモデルマウスの作成は、全く新しい試みであり、再現性のある条件の至適化には予想以上に時間を費やした。加えて、細菌感染モデルも諸条件によりばらつきやすい実験系であり、一定のプロトコールに達し、結果を出すのに１年を費やしたことは、やむをえない範囲と考えている。現在、食塊誤嚥モデルでのサイトカイン動態の解析をすすめているが、この新規モデルの条件が定まったため、今後はよりスムーズに進展すると思われる。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、食塊誤嚥モデルでのサイトカイン動態の解析をすすめている。すなわち、同モデルマウスのRNAを抽出し逆転写後、real-time PCRにより、CCL-2, IL-8, IL-6, IL-10, TGFbeta;, IFNgamma;, TNF-alphaの発現を評価する。さらに、 BALF中の上記サイトカインやIL1betaの蛋白濃度をELISA法により評価する。また、セルロースパウダーの直接的な作用を評価するために、A549肺腺癌培養細胞にセルロースパウダーを投与したときの上記サイトカインの発現を、real-time PCRにより評価しており、まもなく結果を示すことができる。
また、当初の計画とおり、誤嚥性肺炎の治療では、適切な抗生物質の使用にも関わらず炎症所見の低下が遅い例も多い。3のモデルの作製1時間後にオキサシリン 400 mg/kg を腹腔内注射する群と生食のみ腹腔内注射する群を作製し、生存曲線および肺炎発症24時間後と72時間後の肺内の菌量を測定する。
さらに、当初の計画を進展させて、IL-10 や IFNgammaは、インフルエンザウイルス感染回復期の易感染性に関わることが報告されており、それぞれの遺伝子欠損マウスでは、その易感染性が改善している。肺の異物反応においても、皮下での異物反応と同様のサイトカイン動態が認められれば、IL-10欠損マウスやIFNgamma欠損マウスを用いて、セルロース投与群と非投与群の細菌性肺炎モデルにおける肺内の細菌数を比較する。それぞれのマウスはジャクソン研究所より購入可能である。そのほか、それぞれの中和抗体の腹腔内投与が、IL-10やIFNgammaの機能の抑制に利用されており、本研究でもその影響を評価する。
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