ｉＰＳ細胞によるドラッグ・リポジショニング法を用いた新規抗サルコペニア剤の開発

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K08912
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 萩原 圭祐 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 寄附講座准教授 (60423183)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岸田 友紀 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 寄附講座講師 (20423163) ; 中西 美保 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任助教 (40382048)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: iPS細胞 / ドラッグリポジショニング / サルコペニア

Outline of Annual Research Achievements

１．SAMP8マウス由来のｉＰＳ細胞株の樹立。妊娠12日齢のSAMP8マウスから、胎仔を摘出し、マウス胎仔線維芽細胞（以下MEF）を採取し、2日間培養を行いMEFが接着していることを確認した後、MEFを回収し、細胞数を測定後、凍結バイアル（4.0×106cells/vial）を作製した。保存したバイアルから、SAMP8マウス由来MEFを起こし、培養後、6 wellプレートにMEFを播種し、翌日CytoTune-iPS 2.0を用いて山中因子を導入した。作製した山中因子導入済み被験細胞用MEFを、フィーダー細胞上に播種し、9日間培養し、現在までに、iPS細胞様コロニーを確認している。
２．生薬化合物ライブラリーの有効成分同定のためのスクリーニング系の確立。生薬化合物ライブラリーによるスクリーニング実験を行うために、マウス細胞株を使ったスクリーニング系の確立を同時に行った。牛車腎気丸(GJG)は、TNF-αの産生抑制、インシュリン/IGF-1シグナルの活性化、ミトコンドリア遺伝子の活性化の3つのシグナルを活性化する。マウス由来マクロファージ様細胞株RAW264.7細胞を使い、LPS 10ng/ml刺激での培養上清中のTNF-αの産生量がGJG 10、100ug/ml添加により、低下するかどうかをMouse TNF-alpha Quantikine ELISA kitを用いて検討し、GJGのTNF-α産生抑制効果を確認している。マウス骨格筋由来細胞であるC2C12筋芽細胞を、2%horse serumを含む分化培地で分化させ、anti-sarcomeric α-actininで免疫染色し、DAPIで核染し、安定して分化を確認できる系を確立した。C2C12筋芽細胞を分化させ、100nMインスリン刺激下での、グリコーゲン合成量が、GJG 10、100ug/mlを添加により、増加するかをGlycogen Colorimetric Assay KitⅡを用いて、細胞溶解液のグリコーゲン量を検討したところ、GJGの増加作用を確認している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

老化促進マウス研究会の承認と学内のP2申請の許可が下りるのに少し時間を要したが、ほぼ年度内の目標を達成することができた。

Strategy for Future Research Activity

28年度はSAMP8由来のiPS細胞を使って、安定した筋肉細胞の分化誘導の培養系を確立し、すでに確立しているスクリーニング系を使って、化合物の探索を行っていく予定である。
化合物ライブラリーはすでに取得し、研究は順調に推移している。

Causes of Carryover

老化促進マウス研究会の承認と学内のP2申請の許可が下りるのに少し時間を要したことより、老化促進マウス由来のiPS細胞作製開始が少し遅れたため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

老化促進マウス由来のiPS細胞株の多分化能の確認などの品質確認に使用する予定である