2015 Fiscal Year Research-status Report
加齢に伴う動脈硬化形成におけるマクロファージのCYLDの機能解明
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15K08914
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
鷹見 洋一 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90621756)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
樂木 宏実 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20252679)
中神 啓徳 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 寄附講座教授 (20325369)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | CYLD / マクロファージ / 動脈硬化 / 老化 / インフラマソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は脱ユビキチン化酵素(DUB)であるCYLD(cylindromatosis)の急性炎症に伴う血管リモデリングの病態における炎症制御機構について報告してきた。本研究では特に老化による動脈硬化形成における慢性炎症にて中心的な役割を担っているマクロファージ（Mφ）でのCYLDの病態生理機能を解析する。これまで我々は、RAW細胞においてCYLDをノックダウンし酸化LDLを添加すると、IL-1βをはじめとする各種炎症性サイトカインやスカベンジャーレセプターSR-A、CD36、LOX-1、脂質シャペロンFABP4、コレステロールエステル合成酵素ACAT1の発現上昇とともに、脂質取り込みが増加し、より泡沫化が悪化することを示してきた。また、マウス骨髄由来のMφにおいて加齢に伴いCYLDの発現が低下することを確認し、腹腔Mφについての既報告に一致する結果を得た。解析ツールとして、過剰発現のため、レンチウイルスベクターの作成を行い、現在、CRISPR/CAS9システムを用いて府ロックスマウスの作製を試みているところである。RAW細胞、THP-1 Mφを用いて検討した結果、CYLDをノックダウンすることによりインフラマソームの構成分子であるNLRP3の発現が上昇し、IL-1βの分泌が顕著に上昇することが分かった。NFκB活性上昇によるインフラマソームの活性上昇が関与していると考えられるが、現在詳細な検討中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
マクロファージ特異的CYLDノックアウトマウスを作製するべく、CRISPR/CAS9システムを用いてExon1をはさむ2つのLoxP siteのノックインを試みたが、LoxP siteが挟む領域すべて、つまりExon1が欠失したマウスができてしまった。現在、用いるベクターの改良を検討し、再度作成を試みる予定である。
CYLDのin vitroでの検討については、より詳細な脂質取り込みについての解析、石灰化や平滑筋との相互作用などについての解析が必要であるが、各々の解析に必要なpositive controlにおいて十分な差を持った実験条件を決定できておらず、予想外に時間がかかっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在のところ、MφにおけるCYLDの機能として動脈硬化形成についてはインフラマソーム活性調節からのアプローチで、顕著な影響を認めているIL-1βがその病態に関与すると想定しており、より詳細な分子レベルでの解析を進めていく予定である。NFκB活性の調節によるNLRP3発現への関連、更にはにはインフラマソーム活性調節、IL-1βのプロセッシングにおいて蛋白翻訳後修飾に関与していないかも検討したいと考えている。また、それが関与する動脈硬化の炎症病態、つまりMφにおける炎症性分子の発現調節、泡沫化、動脈硬化巣の石灰化、プラークの不安定化、平滑筋細胞との相互作用についてより詳細に検討する。CYLDフロックスマウスの作成に成功すれば、Mφ特異的ノックアウトマウスを作製し、動脈硬化モデルにてin vivoにおけるCYLDの機能を詳細に検討する予定である。また、臨床的な側面からは薬剤や抗加齢作用を有する天然物質のMφにおけるCYLDの発現への影響やヒトサンプルを用いて、SNPsと動脈硬化指標となるような臨床パラメータとの相関を検討したいと考えている。
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| Causes of Carryover |
当該年度の研究費はほぼ予定通りに使用した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
前述のごとく、やや計画より遅れているが、次年度分と合わせ計画通りに使用していく。
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