癌促進型RNA結合蛋白質の分子機構に着目した新規食道癌治療標的の探索

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K08949
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 増田 清士 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部, 准教授 (00457318)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: RNA結合蛋白質 / 食道癌 / 転写後調節機構

Outline of Annual Research Achievements

①研究遂行に必要なバイオリソースの収集と作製
食道扁平上皮癌（ESCC）手術切除症例に関し、免疫組織染色用標本作成（168例）とRNA抽出（６例）を行った。次に公共データベース（TCGAなど）で癌特異的発現変動変化のあるRNA結合蛋白質（RBP）リストを作成した。これらのうち３種類のRBPについて免疫組織染色を行い、ESCCで発現が変動していることを確認した。また、ESCC細胞株パネル（44種類）を用いて、mRNA発現および蛋白質発現量を検討した。
②癌促進型RBP分子が関わるRiboCluster内関連分子の網羅的同定と意義の解明
①で同定したRBPのうち、ESCCで発現が亢進しているRBP（癌促進型RBP）としてTIA1に着目して検討を行った。免疫組織染色で、TIA1はESCCの進展に伴い発現が増加するだけでなく、局在が細胞質優位に変化した。また、細胞質におけるTIA1の発現量は予後と負に相関した。ESCC細胞でTIA1をノックダウンすると、細胞周期がG0/G1期で停止し、足場依存性および足場非依存性増殖が有意に抑制された。TIA1は、２種類のアイソフォーム（TIA1a、TIA1b）があることが知られている。ESCCで見られた細胞質への局在とこれに伴う細胞増殖促進作用はTIA1aに特異的で、TIA1bを強制発現すると細胞死が誘導された。免疫沈降でTIA1と結合するmRNA群を網羅的に解析し、CCNA2、SKP2などの細胞周期制御因子のmRNAを同定した。さらにTIA1はこれらのmRNAの非翻訳領域に結合し、mRNAを安定化（SKP2）または翻訳を促進（CCNA2）することで、これらの蛋白質量を調整することを明らかにした。以上の結果を誌上報告（Oncotarget）するとともに、プレスリリースを行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度に計画していた「研究遂行に必要なバイオリソースの収集と作製」として、ESCC臨床検体バンキングおよび臨床情報のデータベース化が終了し、同定したRBPのうちTIA1に関して、細胞解析用のツールとして最適な細胞株の選択と安定発現細胞株の樹立が終了した。また、TIA1関連分子として複数の細胞周期制御mRNAを同定し、TIA1による発現制御機構の一部を明らかにすることができた。これらの結果をまとめて、学会発表および誌上発表を行っており、おおむね順調に進展していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

RBPの蛋白発現の亢進と局在の変化が、その標的RNAや相互作用する分子の変化に関わることからその背景にある分子機序と、ESCCの進展における意義を解明することを目的とし、以下の研究を行う予定にしている。
a)癌促進型RBPのプロモーター領域に関し、細胞株・臨床検体での変異やメチル化状態（cis）や細胞株における発現状況とレポーターコンストラクトによる転写誘導活性の検討（trans）、ならびに臨床検体での候補転写因子の発現を検討する。
b)癌促進型RBPの細胞内局在には、isoformの違いやリン酸化修飾が関与することを示唆する結果を予備実験で得ている。特に後者は、キナーゼ阻害剤など特異的修飾活性阻害による治療の可能性に繋がることから、(1) Phos-Tagでのリン酸化蛋白濃縮後の質量分析によるリン酸化部位の同定、(2)同定部位の変異体作製及び阻害剤によるリン酸化・脱リン酸化酵素の推定、(3)候補酵素の導入による局在変化の検討、(4)特に活性化型キナーゼの特異抗体を用いた免疫染色による臨床検体での活性と癌促進型RBPの局在との関連を評価し、治療標的としての妥当性を検討する。

Causes of Carryover

本年度に実施予定であった次世代シーケンサーを用いた検討が、当初予定していたよりも安価で実施できた。また、実施予定としていた質量分析を用いた解析を行わなかったことから、その他の項目（施設使用費）で差額が生じた。さらに、情報収集目的に参加予定であった学会への出席を取りやめたため、旅費で差額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度は、本年度に実施予定であった質量分析を用いた検討を行うため、本年度未使用であった助成金と次年度分として請求した助成金を合わせて使用する。また、新たなRBPについて、次世代シーケンサーを用いた検討を行うため、これを使用する予定としている。

Research Products

• [Journal Article] Tumor-promoting function and prognostic significance of the RNA-binding protein T-cell intracellular antigen-1 in esophageal squamous cell carcinoma (2015)
  • Author(s): Hamada J, Shoda K, Masuda K, Fujita Y, Naruto T, Kohmoto T, Miyakami Y, Watanabe M, Kudo Y, Fujiwara H, Ichikawa D, Otsuji E, Imoto I
  • Journal Title: Oncotarget Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.18632/oncotarget.7937.
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Ultraconserved region-containing Transformer 2β4 controls senescence of colon cancer cells (2015)
  • Author(s): Kajita K, Kuwano Y, Satake Y, Kano S, Kurokawa K, Akaike Y, Masuda K, Nishida K, Rokutan K
  • Journal Title: Oncogenesis Volume: - Pages: -
  • DOI: 10.1038/oncsis.2016.18
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Monitoring the HER2 copy number status in circulating tumor DNA by droplet digital PCR in patients with gastric cancer (2015)
  • Author(s): Shoda K, Ichikawa D, Fujita Y, Masuda K, Hiramoto H, Hamada J, Arita T, Konishi H, Komatsu S, Shiozaki A, Kakihara N, Okamoto K, Taniguchi H, Imoto I, Otsuji E.
  • Journal Title: Gastric Cancer Volume: - Pages: -
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Transformer 2β and miR-204 regulate apoptosis through competitive binding to 3' UTR of BCL2 mRNA (2015)
  • Author(s): Kuwano Y, Nishida K, Kajita K, Satake Y, Akaike Y, Fujita K, Kano S, Masuda K, Rokutan K.
  • Journal Title: Cell Death Differ Volume: 22 Pages: 815-825
  • DOI: 10.1038/cdd.2014.176.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel frameshift mutation of CHD7 in a Japanese patient with CHARGE syndrome (2015)
  • Author(s): Kohmoto T, Naruto T, Watanabe M, Masuda K, Suga K, Shono M, Nakagawa R, Kagami S, Imoto I.
  • Journal Title: Hum Genome Variation Volume: - Pages: -
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A novel COL11A1 mutation affecting splicing in a patient with Stickler syndrome (2015)
  • Author(s): Kohmoto T, Naruto T, Masuda K, Morita K, Harada H, Tsuji A, Kashimada K, Enomoto K, Morio T, Imoto I.
  • Journal Title: Hum Genome Variation Volume: 2 Pages: 15043
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Simultaneous detection of both single nucleotide variations and copy number alterations by next-generation sequencing in Gorlin syndrome (2015)
  • Author(s): Morita K, Naruto T, Tanimoto K, Yasukawa C, Oikawa Y, Masuda K, Imoto I, Inazawa J, Omura K, Harada H.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 10 Pages: e0140480
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0140480.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Ectopic Aire expression in 1 the thymic cortex reveals inherent properties of Aire as a tolerogenic factor within the medulla (2015)
  • Author(s): Nishijima H, Kitano S, Miyachi H, Morimoto J, Kawano H, Hirota F, Morita R, Mouri Y, Masuda K, Imoto I, Ikuta K, Matsumoto M.
  • Journal Title: J Immunol Volume: 195 Pages: 4641-4649
  • DOI: 10.4049/jimmunol.1501026.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A unique TBX5 microdeletion with microinsertion detected in patient with Holt-Oram syndrome (2015)
  • Author(s): Morine M, Kohmoto T, Masuda K, Inagaki H, Watanabe M, Naruto T, Kurahashi H, Maeda K, Imoto I.
  • Journal Title: Am J Med Genet Volume: 167 Pages: 3192-3196
  • DOI: 10.1002/ajmg.a.37359.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Deep intronic GPR143 mutation in a Japanese family with ocular albinism. (2015)
  • Author(s): Naruto T, Okamoto N, Masuda K, Endo T, Hatsukawa Y, Kohmoto T, Imoto I.
  • Journal Title: Sci Rep. Volume: 5 Pages: 11334
  • DOI: 10.1038/srep11334.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] RNA binding protein, SSP, induces cell viability of squamous cell carcinoma by posttranscriptional regulation (2015)
  • Author(s): 増田清士、濱田隼一、庄田勝俊、井本逸勢
  • Organizer: 第３８回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県、神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] A novel RNA binding protein, MRF1, induces cell growth in squamous cell carcinoma modulating microRNA expression (2015)
  • Author(s): 増田清士、宮上侑子、濱田哲司、藤田悠司、濱田隼一、庄田勝俊、井本逸勢
  • Organizer: Cell Symposia Human Genomics
  • Place of Presentation: A Star Genome Institute of Singapore （シンガポール）
  • Year and Date: 2015-11-08 – 2015-11-10
• [Presentation] RNA binding protein, SSP, has the isoform-specific function and induces cell viability of squamous cell carcinoma (2015)
  • Author(s): 藤田悠司、増田清士、河本知大、渡邊美季、濱田隼一、庄田勝俊、成戸卓也、井本逸勢
  • Organizer: Cell Symposia Human Genomics
  • Place of Presentation: A Star Genome Institute of Singapore （シンガポール）
  • Year and Date: 2015-11-08 – 2015-11-10
• [Presentation] A novel RNA binding protein, MRF1, induces cell growth in squamous cell carcinoma modulating cancer-associated microRNA expression (2015)
  • Author(s): 増田清士、藤田悠司、濱田隼一、庄田勝俊、井本逸勢
  • Organizer: 第７４回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県、名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-10
• [Presentation] Identification of a RNA binding protein, SSP, inducing cell viability of squamous cell carcinoma by posttranscriptional regulation (2015)
  • Author(s): 濱田隼一、庄田勝俊、増田清士、井本逸勢
  • Organizer: 第７４回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場（愛知県、名古屋市）
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-10
• [Remarks] 食道がんの診断・治療の標的になりうる重要なタンパク質異常の発見
  • URL: http://www.tokushima-u.ac.jp/docs/2016031400069/
• [Remarks] 食道がんの進行を制御する新しい分子（TIA1）の発見とその分子メカニズムの解明
  • URL: http://www.tokushima-u.ac.jp/docs/2016031400076/
• [Remarks] 胃がん患者における循環血中腫瘍 DNA 中の HER2 コピー数のモニタリング
  • URL: http://www.tokushima-u.ac.jp/docs/2016022600102/
• [Remarks] 胃がん治療の重要な標的分子の遺伝子異常を血液で検出
  • URL: http://www.tokushima-u.ac.jp/docs/2016022900011/