2016 Fiscal Year Research-status Report
ヒト検体を用いた消化器癌幹細胞の分化制御機構の解明と遠隔転移抑制法の確立
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15K08970
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
馬場 英司 九州大学, 医学研究院, 教授 (00315475)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
有山 寛 九州大学, 大学病院, 助教 (80713437)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 消化器癌 / 癌幹細胞 / スフェア / 上皮間葉転換 / 組織幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ヒト消化器癌幹細胞の分化、非癌幹細胞の幹細胞性獲得、上皮間葉転換（EMT）などの過程に関わる分子機構を解明することで、消化器癌幹細胞自体を標的にした治療法、EMT過程に伴う癌の浸潤、転移を阻害する治療法の開発を目的としている。そのためには、（１）ヒト消化器癌臨床検体（手術検体、癌性胸腹水など）にわずかに含まれる癌幹細胞を分離する、（２）単一癌幹細胞より安定した培養系を確立する、（３）これらの培養細胞の分化、あるいはEMTを再現する過程における単一細胞レベルでの遺伝子発現・蛋白発現プロファイルを解析する、ことが必要である。ヒト大腸癌に関しては、大腸癌幹細胞（EpCAM高発現, CD44陽性）をフローサイトメトリー（FACS）により分離し、培養によるスフェア形成、免疫不全マウス移植による腫瘍形成の観察技術を基盤として研究を推進した。さらに平成28年度には新たに胃癌手術検体、膵臓癌手術検体からの癌幹細胞、組織幹細胞の候補集団を効率よく分離、培養する条件の最適化を図ってきた。また複数の癌腫における胸腹水中の癌幹細胞の分離、培養も実施した。その結果、胃に関しては組織幹細胞を分離し、培養環境下での分化が確認できた。膵臓の癌幹細胞についてもスフェア形成必要な培養環境を樹立した。（３）に関しては、単一の大腸癌幹細胞から得られたスフェアを単一細胞化して、幹細胞性に関与する遺伝子、蛋白の解析を進め、大腸癌幹細胞のより精密な定義を可能とする分子候補を同定した。本年度から次年度にかけて、この分子を発現する細胞集団における機能解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究計画が対象としているヒト大腸癌幹細胞の分離、培養は順調に行われている。さらに大腸癌や、消化器癌に伴う癌性胸腹水検体からの癌幹細胞の同定、培養も安定して実施されている。これらを用いた大腸癌幹細胞の転移および分化制御機構についての実験を継続し知見が蓄積されてきた。特にこの解析結果をもとに新たな大腸癌幹細胞マーカーの候補分子を同定し、現在は大腸癌転移に及ぼす影響などその機能解析を進めている。その一つとして臨床検体由来癌細胞に対してCRISPR-Cas9システムを用いて当該遺伝子の改変した細胞を樹立し評価を行って居る。
一方、新たに進めてきた胃癌、膵臓癌幹細胞の分離、培養も安定して実施されている。早期癌が多いため十分な腫瘍組織量が確保し難い胃癌については、正常組織からの組織幹細胞の分離、培養が可能となり、これらの癌幹細胞化の機序も合わせて解析中である。分離、培養によりスフェア形成した癌幹細胞については、抗体による多重染色を行いFACS解析と共焦点レーザー顕微鏡観察、および単一細胞PCR法による遺伝子解析、さらに免疫不全マウスへの移植などの実験は安定して実施されている。予定されていた臨床検体由来癌細胞へのEMT関連遺伝子の導入も行い解析を行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒト臨床検体より分離し培養した大腸癌幹細胞は、スフェア形成過程あるいは免疫不全マウス移植での造腫瘍過程を通じて癌幹細胞から非癌幹細胞への分化を再現すると考えられる。現在我々は、この分化は2-4の段階を経ていると想定しており、単一細胞PCR解析を進めることで、それぞれの段階に特異的に発現する遺伝子の同定、そしてその遺伝子産物の癌幹細胞性や転移・浸潤能における生物学的機能の解明を引き続き目指す。またこれらの過程に重要な分子を同定し、その機能解析により新たな癌幹細胞の転移能などの修飾機序の解明を行ってゆく。癌細胞におけるこれらの機能の修飾により、癌幹細胞性や転移・浸潤能、および薬剤耐性への影響を解析する予定である。
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| Causes of Carryover |
これまで研究成果により、大腸癌の単一幹細胞から形成されるスフェアは、癌幹細胞から非癌幹細胞への分化過程で複数の段階を経ること、また分化した癌細胞が特定の刺激により癌幹細胞の性質を再び取得することが判明した。これらの過程で重要な分子を同定した後に、これを実証するために多数の大腸癌患者検体から同様の解析を行うことを計画している。現在候補分子をほぼ選択したが、その癌幹細胞における機能を慎重に解析後、次年度に実施することとした。また新たに胃癌や膵癌の癌・組織幹細胞の分離、培養法の最適化の検討を進め、ほぼ順調に実験手法を確立できたため、次年度にはその手法に沿ってより多くの検体を用いた培養実験を要することが予想される。以上の理由から次年度使用額が生じたものである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
上記のように多数の臨床検体からのスフェアを用いた解析、また大腸癌に加え胃癌、膵臓癌の癌・組織幹細胞の分離、培養に必要な試薬の購入に充てる予定である。
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