2015 Fiscal Year Research-status Report
TRPA1チャネルを標的とした消化管狭窄治療薬のin vivoスクリーニング
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15K08978
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
倉原 琳 (海琳) 福岡大学, 医学部, 講師 (00341438)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 消化管線維化狭窄 / 線維芽細胞 / TRPA1 / カルシウム / コラーゲン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
臓器線維化は慢性炎症に伴って臓器の機能を担う上皮組織がＩ型コラーゲンなどの細胞外マトリックスに置き換わる症状である。臓器線維化が進行すると最終的に臓器不全に至る。臓器不全が死に直結する肺の線維化疾患では、国内で１万人以上の患者がいる特発性肺線維症が挙げられる。消化管・肺・肝臓・皮膚などの線維化病変の進行を抑制するのにステロイドやその類似薬が広く使用されるが、その抗線維化の作用機序は未だ解明されていない。これらの線維化疾患に対して重篤な場合は外科治療を除いて有効な治療法がなく、治療薬の開発に向けた組織線維化のメカニズム解明が急がれている。
線維化をもたらす原因として、活性化した線維芽細胞が線維化部位に集積し、Ｉ型コラーゲンを大量に産生することが明らかになっています。特に、α-SMAと呼ばれる平滑筋型アクチンを発現する線維芽細胞（筋線維芽細胞）が、細胞外マトリックスたんぱく質を高発現することが知られている。筋線維芽細胞は線維芽細胞の亜種であり、消化管粘膜上皮下の部分に分布し、消化管障害の初期に種々のサイトカインや成長因子に応答して病変部へ遊走し創傷治癒に寄与する。その過剰反応が線維化に関わる。TRPA1チャネルは消化器系や呼吸器系に発現が多く認められ、温度感受性を持ち、わさび、ニンニク、マスタード、山椒、生姜などに含まれる成分で活性化される。これまでの培養細胞を用いた実験を通して、ステロイド・ピルフェニドン・グリチルリチンなどの様々な抗線維化薬が消化管線維芽細胞TRPA1チャネルを活性化して抗線維化作用を示すことが分かった。食品成分が線維芽細胞TRPA1チャネルへの影響、線維化シグナルへの作用について盲試験でスクリーニングした。現在TRPA１ノックアウトマウスを用いたin vivo実験を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々のIn vitro実験結果によると、線維芽細胞TRPA1チャネルが活性化されると、TGF下流のリン酸化シグナルが抑制され、線維化に関わるマスター転写因子であるmyocardin(MYOCD)の発現レベルを抑制することによって、1型コラーゲン・α-SMA・N-カドヘリンの発現を有意に抑制することが分かった。
福岡県生物食品研究所から、TRPA1活性化物質・またはそれに類似性を持つ食品（香辛料・果物・海産物など）エタノール抽出成分103種類の提供を受け、現在細胞レベルで、これら食品成分が消化管筋線維芽細胞TRPA1チャネルへの影響、線維化シグナルへの作用について盲試験でスクリーニングした結果について福岡大学と共同で特許申請中である。特許申請には３つの新しく発見した植物成分を届けておりますが、これ以外にも甘草のエタノール抽出成分がTRPA1チャネルを活性化して抗線維化作用を示すことがわかった。これをヒントに、グリチルリチン、グリチルレチン酸、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロンなどステロイド様成分がTRPA1チャネルの活性化を介して抗線維化作用を示すことをin vitroで証明した。→権利譲渡証書（304-255）発明の名称「間葉系細胞TRPA1チャネルの活性化を介した組織線維化の予防または治療」発明者：倉原琳 →福岡大学産知第１０号 特願2015-229481 また、2014年に大阪大学微生物病研究所の特定非営利活動法人「発生工学研究会」に依頼してCRISPR/Casシステムを用いたTRPA1-KO（CRISPR）マウスを作製した（2016年現在に10代戻し交配済）。現在既にのノックアウトマウスを用いてin vivo実験を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
1.既知の報告と培養細胞を用いた予備実験のデータに基づき、TRPA1-KO（CRISPR）マウス、WTマウスを用いた腸炎線維化(TNBS投与)を作成し、組織免疫学的に消化管筋線維芽細胞のTRPA1チャネルを介する抗線維化狭窄作用の検討。WTマウスおよびTRPA1-KO（CRISPR）マウスのコントロールGroupマウス大腸の正常部位、腸炎誘発Groupマウスの炎症部位；狭窄部位の組織を採取し、MT（マッソントリクローム）染色による線維化の評価・組織上皮細胞・筋線維芽細胞の形態・局在の変化をレーザー共焦点顕微鏡による組織免疫染色法で精査する。また、組織から単離した上皮細胞、筋線維芽細胞の一次培養系を確立する。筋線維芽細胞におけるストレスファイバーの形成、EGF, TGF, PDGF, VEGF, FGFなどの増殖因子、サイトカイン・ケモカイン放出；コラーゲン・MMP・TIMP、TRPの発現の変化をデジタルリアルタイムPCRや免疫ブロットで評価する。
2.上皮間葉転換・線維芽細胞→筋線維芽細胞形質転換の現象に焦点をあて、線維化モデルマウスでTRPA1チャネルの有無が、線維化の進行への影響の評価。単離した上皮細胞・筋線維芽細胞のCa2+動態や膜電流の変化について、デジタルCa2+イメージング法やパッチクランプ法による比較検討を行い、イオンチャネルと炎症・狭窄の病態生理学的意義を探る。
3.生物食品研究所によりTRPA1を活性化する可能性のある食品成分ライブラリーから抗線維化作用があるものをin vivoスクリーニングによって作用を確認し、線維化モデルマウスの線維化の発症や進行への治療効果の検討。
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| Causes of Carryover |
予定していた遺伝子改変動物実験について、動物の繁殖スピードが遅いため、実験スケジュールが全体的に遅延したため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繰越分は動物実験用のものであり、2016年度に加速して遺伝子改変動物実験を完了させる予定である。
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[Journal Article] Modulation of cardiac connexin-43 by omega-3 fatty acid ethyl-ester supplementation demonstrated in spontaneously diabetic rats.2015
Author(s)
Radosinska J, Kurahara LH, Hiraishi K, Viczenczova C, Egan Benova T, Szeiffova Bacova B, Dosenko V, Navarova J, Obsitnik B, Imanaga I, Soukup T, Tribulova N.
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Journal Title
Physiological Research
Volume: 64
Pages: 795-806
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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