2017 Fiscal Year Research-status Report
自己骨髄細胞と肝幹細胞増殖因子による肝再生療法の基礎研究
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15K08983
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
齋藤 貴史 山形大学, 医学部, 教授 (80250918)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 骨髄細胞 / 肝再生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ラット骨髄細胞と肝前駆細胞（hepatic stem-like cell）の共存下において、各々が産生する液性因子を細胞間で往来可能としたin vitro共培養システムを開発し、骨髄細胞側で遺伝子発現の増強が確認されたFGF2とEpireglinが肝前駆細胞の肝細胞方向性への分化に重要であることを明らかにしている。Epireglinは、EpCAM陽性肝前駆細胞の肝細胞方向性への分化誘導ならびに増殖能の増加に関与し、C57BL/6マウスに0.1%3,5-dietoxy-1,4-dihydrocollidine(DDC)を含む飼料を与え作成した肝障害モデルでは、肝前駆細胞で構成された偽胆管周囲の間葉系細胞を含むstem-cell nicheから発現していることを確認しているが、更に、肝障害の進行程度に応じてその遺伝子発現量および蛋白発現量が増加することが示された。Epireglinは、肝前駆細胞の肝細胞方向性への分化誘導ならびに肝前駆細胞の増殖に関与していることが示唆された。患者血清を用いて、急性肝不全、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、健常者について、血清Epireglin値をELISA法で測定したが、血清Epireglinは、肝前駆細胞の出現が肝障害の回復に寄与するとされる劇症肝炎の急性肝不全例において、他の群に比較し有意な上昇を示し，肝臓再生に深く関わっていることが示されている。本液性因子の肝前駆細胞刺激因子としての重要性が確認され、骨髄細胞が重症肝障害において肝組織の修復に重要な役割の一端を担うことが示唆された。更に、骨髄細胞が及ぼす肝再生効果を検討するため、新規の大型動物モデルとして、ミニブタ、ゲッティンゲン種（月齢12ヶ月以内）を用いて、四塩化炭素（CCL4）を12週間腹腔内投与し、肝臓線維化と炎症を惹起させミニブタ肝障害モデルを作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
肝不全に対する自己骨髄細胞投与療法の有効性を高め投与法を発展させるため、骨髄細胞からの有効な肝幹細胞増殖因子を同定して、それらの自己骨髄細胞投与時の補完的な役割を見いだし、さらに新規の動物モデルを作成して高度肝障害に対する骨髄細胞投与の有効性を実証することを目標に研究を進めている。現在までにFGF2とEpireglinが、自己骨髄細胞投与療法時の肝前駆細胞に対する治療有効性を高めるための肝幹細胞増殖因子として、肝前駆細胞の肝細胞方向性への分化、および肝前駆細胞そのものの増殖、の両面において、有効な液性因子候補である可能性が見出された。そして、Epireglinは高度肝障害マウス肝で発現増加し、肝前駆細胞で構成された偽胆管周囲の間葉系細胞を含むstem-cell nicheから発現していたことからも、肝細胞傷害を受けている部位で、肝幹細胞へ分化・増殖を働きかけていることが肝臓組織内で確認された。血中のEpireglin値は、臨床例の血清においても、肝再生に肝幹細胞の動員を必要とすることが想定される急性肝不全症例でのみ高値を示し、予後良好の急性肝炎や長期間の経過のなかで進行する慢性肝障害では上昇しないことから、Epireglinは肝再生における肝細胞増殖因子としての重要性が確認されたことになる。Epireglinは、新規の肝幹細胞増殖因子となり得る可能性があることが確認された。高度肝障害時に誘導される骨髄細胞由来の再生因子は、多臓器分化能が確認されたMuse細胞の投与により、より有効に作用することが想定される。ミニブタ大型肝障害モデルを作成し、この多臓器分化細胞の肝組織修復効果を検討しているが、個体差も見られるため更なる検討が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
骨髄細胞で発現増加する肝幹細胞増殖因子として同定されたEpireglinは新規の液性因子であり、肝細胞方向性への分化・増殖に関わる機序について、培養細胞における肝特異遺伝子の発現などの検討を更に進める。大型動物ミニブタ肝障害モデルとして、ミニブタ、ゲッティンゲン種（月齢12ヶ月以内）を用いて四塩化炭素（CCL4）を12週腹腔内投与し、肝障害モデルを作成した。骨髄細胞に存在するMuse細胞は遺伝子改変を伴わず、多臓器分化能を有しており、障害臓器を認識して自発的に分化し、組織修復が行われるという特徴がある。したがって、本細胞の投与は骨髄細胞全体の投与より効果的に肝組織の修復が起こることが期待される。そこで、Muse細胞をCCL4投与大型肝障害動物モデルに耳静脈から全身投与し、血液・生化学的検討、病理学的検討を行ったところ、蛋白生合成指標であるアルブミンやプロトロンビン時間活性は改善傾向を示し、また肝線維化の指標として肝組織内のα-SMAの発現が低下した。しかし、個体差も見られるため、実験例数を増加させ、更なる検討も必要である。本モデルにおいて、今までの研究で明らかとなった骨髄細胞に由来する肝幹細胞の再生促進因子の動態を含め、肝組織や血清を詳細に検討して、骨髄細胞の肝再生に対する有用性を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
（理由）研究機関内における所属講座の異動に伴い研究環境の整備が必要となり、研究の一部を次年度に予定したため、研究物品の購入が必要となり次年度の使用額が生じた。
（使用計画）細胞における肝特異遺伝子の発現、新規肝障害モデルにおける血液・生化学検討および病理組織学的検討、増殖再生因子の検討、等のため、遺伝子工学用試薬、遺伝子工学用器具、一版薬品などの消耗品を購入する（550千円）。データ処理や成果発表に伴う一般文具消耗品、印刷費および論文掲載費を予定する（100千円）。学会における研究情報の収集や成果の発表などの旅費を予定する（150千円）。
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