2015 Fiscal Year Research-status Report
非古典的Wntシグナルを介した肝幹・前駆細胞の分化調節機構の解明
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15K08989
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
東 正新 (陳正新) 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (10376783)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柿沼 晴 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 寄附講座講師 (30372444)
朝比奈 靖浩 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 寄附講座教授 (00422692)
渡邉 守 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (10175127)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 幹細胞 / 発生・分化 / 再生医学 / 肝疾患治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者らのグループは、本研究において、(1)非古典的経路Wntリガンドを介するシグナルを中心として、細胞表面抗原によって高度に濃縮した肝幹細胞画分を用いて、その分化・増殖に関わる新たな分子機構を解析し、(2)この結果に基づき、PiggyBac Transposon法を用いてWntシグナルを調節しうるヒトiPS細胞株を作成し、その分化・増殖機構を解明する。さらに (3) 有用な下流分子の同定した後に、低分子化合物ライブラリを用いて下流分子の活性化を調節しうる化合物を探索する研究を行い、今年度の成果として下記を得た。
(1)非古典的経路Wntリガンドを介するシグナルを中心とした肝幹細胞画分の分化・増殖に関わる新たな分子機構の解析：リン酸化アレイシステムを用いた網羅的な解析によって、肝幹細胞画分では非古典的経路WntリガンドはCaMKII以外には強く作用していなかった。関連シグナルの探索を進めた結果、Bone Morphogenetic Protein-4 はWnt5aと協調的に作用して、CaMKIIの活性化をコントロールする結果を得た。本研究成果は、さらに詳細な検討を重ねつつ、原著論文を投稿中である。さらに関連シグナルとしてMMP-14の機能解析を行い、MMP-14は肝幹/前駆細胞の胆管管腔形成を正に制御することが示され、報告した（Otani et al, Biochem Biophys Res Commun, 2016）。
(2)PiggyBac Transposon法を用いて関連分子を調節したヒトiPS細胞株の作成と、その分化・増殖機構の解明：関連した転写因子であるProx1の強制発現細胞株の樹立に成功し、現在はその結果を解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画したとおり、(1)肝幹細胞画分の分化・増殖に関わる新たな分子機構の解析に関しては想定通りの進捗を得た。すなわち、Bone Morphogenetic Protein-4 はWnt5aと協調的に作用して、CaMKIIの活性化をコントロールし、胆管形成を負に制御することが示され、新規の知見を発見した。この成果は現在、結果を原著論文として投稿している。さらには、MMP-14の欠乏が肝細胞成熟化をEGFシグナルを介して正に制御すること、逆に胆管の管腔形成を遅延させることが示され、本結果を原著論文として発表した。この結果は、MMP-14の肝幹/前駆細胞における機能を初めて報告したものである。(2)PiggyBac Transposon法を用いて関連分子を調節したヒトiPS細胞株の作成と、その分化・増殖機構の解明については、細胞株の作成に成功したところであり、その形質を評価しているところである。有望な結果を得た場合には、関連分子をCrispr/Cas9系によるknock out細胞の樹立を計画することも視野に入れている。これらの結果を基盤に、次年度はさらに研究を発展させることが期待できると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
前記の(1), (2)に関しては平成27年度の結果に基づき、さらにこれを継続して遂行する。
さらに下記の(3)低分子化合物ライブラリを用いたスクリーニングに関しても、これまでの成果を基盤に推進してゆく。
研究グループでは、既にケミカルライブラリーを対象としてスクリーニングを行う手法を確立し、報告している（Antimicrob Agent Chemother, 2012）。そこで、Wnt5a関連分子のreporter geneを同定できれば、これを検出できるreporter plasmidを作成し、Lentiviral vectorを用いて恒常発現細胞を樹立する。これを用いて、低分子化合物スクリーニングによりWnt5a関連分子を増強/低下させる化合物を探索する。当該施設が有する生物活性が未知で構造的多様性をもつケミカルライブラリーを対象としてスクリーニングを行う。抽出された候補化合物については、構造活性相関解析を行い、類縁化合物での反応を確認することで、活性に重要な化学構造を明らかとする。
同定した化合物を用いて、ゲノム修飾をしていないヒトiPS細胞を用いて、Wnt5a関連分子の調節により、肝幹･前駆細胞への誘導効率と分化の様態に変化がおきるか否かを検証する。
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| Causes of Carryover |
消耗品として購入を検討していた試薬等が、計画当初より廉価で購入可能であったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今後の解析をさらに発展させるため、検討する数・種類を拡大して解析を行うため、試薬を増量して購入する予定である。
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[Journal Article] Matrix Metalloproteinase-14 Mediates Formation of Bile Ducts and Hepatic Maturation of Fetal Hepatic Progenitor Cells.2016
Author(s)
Otani S, Kakinuma S, Kamiya A, Goto F, Kaneko S, Miyoshi M, Tsunoda T, Asano Y, Kawai-Kitahata F, Nitta S, Nakata T, Okamoto R, Itsui Y, Nakagawa M, Azuma S, Asahina Y, Yamaguchi T, Koshikawa N, Seiki M, Nakauchi H, Watanabe M.
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Journal Title
Biochem Biophys Res Commun
Volume: 469
Pages: 1062-1068
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Efficacy of additional radiofrequency ablation after transcatheter arterial chemoembolization for intermediate hepatocellular carcinoma.2016
Author(s)
Azuma S, Asahina Y, Nishimura-Sakurai Y, Kakinuma S, Kaneko S, Nagata H, Goto F, Ootani S, Kawai-Kitahata F, Taniguchi M, Murakawa M, Watanabe T, Tasaka-Fujita M, Itsui Y, Nakagawa M, Watanabe M.
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Journal Title
Heptol Res
Volume: 46
Pages: 312-9
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Evaluation of IFN resistance in newly established genotype 1b HCV cell culture system.2016
Author(s)
Taniguchi M, Tasaka-Fujita M, Nakagawa M, Watanabe T, Kawai-Kitahata F, Otani S, Goto F, Nagata H, Kaneko S, Nitta S, Murakawa M, Nishimura-Sakurai Y, Azuma S, Itsui Y, Mori K, Yagi S, Kakinuma S, Asahina Y, Watanabe M.
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Journal Title
J Clin Transl Hepatol
Volume: 4
Pages: 5-11
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Impaired induction of IL28B and expression of IFNλ4 associated with non-response to interferon-based therapy in chronic hepatitis C.2015
Author(s)
Murakawa M, Asahina Y, Nakagawa M, Sakamoto N, Nitta S, Kusano-Kitazume A, Watanabe T, Kawai-Kitahata F, Otani S, Taniguchi M, Goto F, Nishimura-Sakurai Y, Itsui Y, Azuma S, Kakinuma S, Watanabe M.
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Journal Title
J Gastroenterol Hepatol
Volume: 30
Pages: 1075-84
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Human induced pluripotent stem cell-derived hepatic progenitor-like cells and hepatocyte-like cells as a model for interaction between hepatitis B virus and host cells.2015
Author(s)
Kaneko S, Kakinuma S, Asahina Y, Kamiya A, Nitta S, Tsunoda T, Miyoshi M, Nagata H, Goto F, Otani S, Murakawa M, Kawai-Kitahata F, Itsui Y, Nakagawa M, Azuma S, Watanabe M.
Organizer
American Association for the Study of Liver Diseases, The Liver Meeting 2015
Place of Presentation
San Francisco (USA)
Year and Date
2015-11-16 – 2015-11-16
Int'l Joint Research
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[Presentation] 肝幹/前駆細胞におけるMatrix Metalloproteinase-14による分化調節機構の解析2015
Author(s)
大谷 賢志, 柿沼 晴, 後藤 文男, 紙谷 聡英, 櫻井 幸, 井津井 康浩, 東 正新, 中川 美奈, 朝比奈 靖浩, 坂本 直哉, 中内 啓光, 渡辺 守
Organizer
第51回日本肝臓学会総会
Place of Presentation
ホテル日航熊本（熊本県熊本市）
Year and Date
2015-05-21 – 2015-05-21
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[Presentation] Gene alterations in tert promoter, CTNNB1, and TP53 are closely associated with development and prognosis of hepatocellular carcinoma: comprehensive analyses by next generation sequencing technology.2015
Author(s)
Asahina Y, Kawai-Kitahata F, Kaneko S, Nagata H, Goto F, Otani S, Taniguchi M, Murakawa M, Nitta S, Watanabe T, Tasaka-Fujita M, Nishimura-Sakurai Y, Itsui Y, Nakagawa M, Azuma S, Kakinuma S, Tanaka S, Tanabe M, Enomoto N, Watanabe M.
Organizer
European Association of the Study of Liver Disease, 50th The International liver congress
Place of Presentation
Vienna (Austria)
Year and Date
2015-04-22 – 2015-04-22
Int'l Joint Research
