2015 Fiscal Year Research-status Report
肝癌における癌悪性化シグナルを標的とした新規治療法の確立
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15K08999
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
白羽 英則 岡山大学, 大学病院, 講師 (40379748)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
桑木 健志 岡山大学, 大学病院, 助教 (80643387)
大西 秀樹 岡山大学, 大学病院, 助教 (30595468)
中村 進一郎 岡山大学, 大学病院, 助教 (70514230)
能祖 一裕 岡山大学, 医学部, 客員研究員 (10314668)
岩室 雅也 岡山大学, 大学病院, 助教 (30645403)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 肝細胞癌 / Notchシグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Notchシグナルと他の肝癌悪性化関連転写因子の検討において、肝癌培養細胞Hep3B, Huh7, HLE, SK-Hep-1を用いて検討を行い、Notchシグナルの活性化により転写因子Twist発現が亢進する事をWestern blottingにより確認した。癌抑制遺伝子Runt-related transcription factor 3 (RUNX3)のプラスミド導入によりRUNX3蛋白質の発現は亢進し、RUNX3-siRNAの導入によりRUNX3蛋白質の発現は低下することもWestern blottingにより確認した、これらの細胞操作により肝癌培養細胞におけるNotchシグナルを制御することが可能であることが確認された。また、Notchシグナルの活性化により下流シグナルのHey, HESが活性化することもWestern blottingにより確認した。更に肝癌の癌幹細胞マーカーであるEpCAMの発現が亢進する事も確認できた。Notchシグナルの活性化は、E-cadherin発現を低下させ、細胞移動能を亢進させることも確認した。同様に上皮間葉転換（Epithelial-Mesenchymal Transition：EMT）に関連するN-cadherinやvimentinの発現も亢進した。これらの成果によりNotchシグナルの活性化は、肝細胞癌細胞の癌幹細胞化のみならす、EMTも亢進させることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度の最大の目的は、RUNX3遺伝子の導入及びsiRNAによる遺伝子発現コントロールによりNotchシグナルの制御を確認することである。Notchシグナルの活性化により肝癌のEMT及び幹細胞化を引き起こすTwistの発現が亢進することが確認できた。
また、我々の細胞制御系によりNotchシグナル下流分子であるHES, Heyの発現が制御されること、細胞移動能活性化、E-cadherin制御などによりEMTが制御されている事も確認できた。以上より当該研究は、おおむね順調に進行していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 癌幹細胞化による抗癌剤耐性化機構の解明： a. in vitroでの癌幹細胞化と抗癌剤耐性化の関連を検討：遺伝子発現制御肝癌培養細胞を5FU(0.01-100nM),cisplatin（0.01-100nM）を含む培地で培養し、5FUの抗癌剤効果を検討する。Notchシグナル活性化やMRP1-5の発現に与える影響についてはWestern blotで検討する。b. in vivoの検討：SCIDマウス実験モデルにおける癌幹細胞抑制療法の検討：2bと同様に腫瘍モデルを作成し、2, 4, 6, 8週で剖検し、腫瘍径、重量を測定する。上記モデルに5FU, cisplatinを腫瘍接種後2週より週に一度腹腔内投与する。5FU(20 mg/kgを中心に検討), cisplatin(2.5 mg/kgを中心に検討)との併用による効果を評価する。摘出した腫瘍は免疫染色及びWestern blotによりNotchシグナル、幹細胞マーカー、MRP1-5発現を評価する。
2. 臨床検体を用いた検討: 5FUとcisplatinの併用療法施行前に、肝癌組織の採取し、標本の癌部、非癌部組織を用いて検討を行う。a. Jagged-1, Notch, Hey, HES, Twist, RUNX3, 癌幹細胞化マーカーの発現・活性化をWestern blot , 免疫組織染色により評価する。b. aの分子発現との関連性について、MRP1-5発現と合わせてWestern blot 及び免疫組織染色により評価する。肝組織での検討結果とin vitro実験での解析結果に解離がある場合には、分化度別の組織を用いたマイクロアレイ解析を用いて、その他の癌幹細胞化、抗癌剤耐性化関連分子の抽出を行う。
3. 癌幹細胞抑制療法の検討: Hep3B, PLC, Huh7, HLE, SK-Hep1と、RUNX3発現およびTwist発現を制御した遺伝子改変肝癌培養細胞を用いる。これら細胞をγセクレターゼ阻害剤で処理し、幹細胞機能、抗癌剤耐性化克服の効果を検討する。
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| Causes of Carryover |
細胞培養などに使用する試薬を、所属教室の共同試薬を使用したため、残金が生じた。
研究分担者の大西、岩室の使用がないが、共同試薬及び他の分担者の研究費で購入した試薬で研究は遂行している。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繰越金は、平成28年度の細胞培養試薬及び抗癌剤、抗体など実験試薬購入に使用する。
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[Journal Article] Loss of Runt-related transcription factor 3 induces resistance to 5-fluorouracil and cisplatin in hepatocellular carcinoma.2016
Author(s)
Kataoka J, Shiraha H, Horiguchi S, Sawahara H, Uchida D, Nagahara T, Iwamuro M, Morimoto H, Takeuchi Y, Kuwaki K, Onishi H, Nakamura S, Takaki A, Nouso K, Yagi T, Yamamoto K, Okada H.
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Journal Title
Oncology Reports
Volume: 35
Pages: 2576-2582
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Hepatic stellate cells promote upregulation of epithelial cell adhesion molecule and epithelial-mesenchymal transition in hepatic cancer cells.2016
Author(s)
Nagahara T, Shiraha H, Sawahara H, Uchida D, Takeuchi Y, Iwamuro M, Kataoka J, Horiguchi S, Kuwaki T, Onishi H, Nakamura S, Takaki A, Nouso K, Yamamoto K.
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Journal Title
Oncology Reports
Volume: 34
Pages: 1169-1177
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Potential of alpha-fetoprotein as a prognostic marker after curative radiofrequency ablation of hepatocellular carcinoma.2015
Author(s)
Dohi C, Nouso K, Miyahara K, Morimoto Y, Wada N, Kinugasa H, Takeuchi Y, Kuwaki K, Onishi H, Ikeda F, Nakamura S, Shiraha H, Takaki A, Okada H.
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Journal Title
Hepatology Researvh
Volume: 1
Pages: 1-2
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] ソラフェニブ治療による長期生存例の検討2015
Author(s)
足立 卓哉, 能祖 一裕, 和田 望, 森元 裕貴, 竹内 康人, 桑木 健志, 大西 秀樹, 中村 進一郎, 白羽 英則, 高木 章乃夫, 山本 和秀
Organizer
JDDW2015
Place of Presentation
東京
Year and Date
2015-10-08 – 2015-10-11
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