B型慢性肝疾患におけるインターフェロン抵抗性メカニズムの解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09002
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 柘植 雅貴 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 助教 (50448263)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: B型肝炎ウイルス / インターフェロン / 治療抵抗性

Outline of Annual Research Achievements

B型肝炎ウイルス（HBV）は、インターフェロン治療に対し強い耐性を示すことから、HBV genotypeによるIFN治療反応性の違いに着目し、HBVのインターフェロン抵抗性獲得のメカニズムを解明し、研究を開始した。まず、ヒト肝細胞キメラマウスの肝組織より作製されたヒト肝細胞（PXB細胞）に対し、HBV genotype Cを感染させた後、細胞を回収。非感染細胞および感染細胞からそれぞれtotal RNAを抽出後、次世代シークエンサーを用いて、遺伝子発現解析を行った。HBV感染に伴い、有意な発現変化を認めた遺伝子群を抽出した後、パスウェイ解析を施行したところ、免疫応答に関与する遺伝子群が有意に制御されていることが確認された。さらに、詳細に解析を行ったところ、Toll like receptorシグナルに関与する遺伝子（CXCL familyなど）が強く誘導されていることが分かった。また、Ingenuity pathway analysisを用いた解析では、インターフェロンシグナルに関与する遺伝子が発現更新していることが、確認された。C型肝炎領域では、肝細胞内でのインターフェロン誘導遺伝子発現が低い症例においてインターフェロン反応性が良いといった報告もあることから、HBV感染に伴うインターフェロン誘導遺伝子の発現亢進は、HBVのインターフェロン抵抗性獲得メカニズムの一部に関与している可能性も考えられる。今後は、HBV genotype A感染細胞での遺伝子発現変化も解析し、より強くインターフェロン抵抗性獲得に寄与する遺伝子を同定するとともに、HBVによる標的遺伝子の制御メカニズムの同定と標的遺伝子発現制御によるインターフェロン反応性の変化について解析していく予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

HBV感染PXB細胞の遺伝子発現解析を次世代シークエンサーを用いて解析することにより、これまでin vivoで行ってきた解析結果とほぼ同等の結果が得られている。in vivoではHBV genotype A感染時にウイルス量の増加が遅いなどの問題があったことから、PXB細胞を用いることでその影響が回避できる可能性が高いものと推測できる。さらに、遺伝子発現解析におけるデータも、PXB細胞でも十分得られることが確認できたことから、研究はおおむね順調に進んでいるものと判断した。

Strategy for Future Research Activity

HBV genotype A感染PXB細胞を用いた遺伝子発現解析結果と比較し、HBV genotypeによるヒト肝細胞の反応性の差異を明らかにし、その反応性の相違からインターフェロンや核酸アナログに対する感受性に寄与する遺伝子の同定を試みる。さらに、次年度は、当初の計画の通り、抽出されたIFN抵抗性関連遺伝子とHBV関連蛋白との相互作用について検討していく予定である。HBV感染による遺伝子発現制御は、転写レベルもしくはmRNA安定性による制御が考えられることから、遺伝子発現制御メカニズムを詳細に解析するため、抽出されたIFN感受性関連遺伝子のプロモーターを用いたレポーターアッセイのほか、HBV存在下・非存在下におけるmRNA、蛋白の発現変化についてもリアルタイムPCR、ウエスタンブロットにて解析し、遺伝子発現制御がどのレベルで生じているか詳細に解析する。さらに、次年度から次々年度にかけて、ヒト肝細胞キメラマウスを用いた研究を行い、HBV genotype Aおよびgenotype C感染マウスに対し、ヒトPBMCを投与し劇症肝炎モデルの作製を試みる。その際、臨床的にはHBV genotype A感染においてALTが低めであり、肝炎が遷延することが多いことから、ヒトPBMCを接種することで生じる肝細胞内での炎症（肝炎）の程度を評価し、臨床病態との相関を評価する予定である。また、次世代シークエンサ解析にて抽出された標的遺伝子の発現を制御することで、肝組織の炎症が変化するか否かについても解析する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Effect of tenofovir disoproxil fumarate on drug-resistant HBV clones. (2016)
  • Author(s): Murakami E., Tsuge M., Hiraga N., Kan H., Uchida T., Masaki K., Nakahara T., Ono A., Miki D., Kawaoka T., Abe H., Imamura M., Aikata H., Ochi H., Hayes C.N., Akita T., Tanaka J. and Chayama K.
  • Journal Title: Journal of Infection Volume: 72 Pages: 91-102
  • DOI: 10.1016/j.jinf.2015.09.038
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Improvement of renal dysfunction in a patient with HCV-related liver cirrhosis by daclatasvir and asunaprevir combination therapy: A case report. (2016)
  • Author(s): Tsuge M, Hiramatsu A, Shinohara F, Nakano N, Nakamura Y, Hatooka M, Morio K, Morio R, Kan H, Fujino H, Uchida T, Kobayashi T, Fukuhara T, Masaki K, Nakahara T, Ono A, Nagaoki Y, Miki D, Kawaoka T, Hiraga N, Imamura M, Kawakami Y, Aikata H, Ochi H, Hayes CN, Chayama K.
  • Journal Title: Hepatology Research Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • DOI: 10.1111/hepr.12629.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Antiviral effects of anti-HBs immunoglobulin and vaccine on HBs antigen seroclearance for chronic hepatitis B infection. (2016)
  • Author(s): Tsuge M, Hiraga N, Uchida T, Kan H, Miyaki E, Masaki K, Ono A, Nakahara T, Abe-Chayama H, Zhang Y, Naswa MG, Kawaoka T, Miki D, Imamura M, Kawakami Y, Aikata H, Ochi H, Hayes CN, Chayama K.
  • Journal Title: Journal of Gastroenterology Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] On-treatment low serum HBV RNA level predicts initial virological response in chronic hepatitis B patients receiving nucleoside analogue therapy. (2015)
  • Author(s): Huang Y.W., Takahashi S., Tsuge M., Chen C.L., Wang T.C., Abe H., Hu J.T., Chen D.S., Yang S.S., Chayama K. and Kao J.H.
  • Journal Title: Antiviral therapy Volume: 20 Pages: 369-375
  • DOI: 10.3851/IMP2777
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Factors associated with the effect of interferon-alpha sequential therapy in order to discontinue nucleoside/nucleotide analog treatment in patients with chronic hepatitis B. (2015)
  • Author(s): Matsumoto A., Yatsuhashi H., Nagaoka S., Suzuki Y., Hosaka T., Tsuge M., Chayama K., Kanda T., Yokosuka O., Nishiguchi S., Saito M., Miyase S., Kang J.H., Shinkai N., Tanaka Y., Umemura T. and Tanaka E.
  • Journal Title: Hepatology Research Volume: 45 Pages: 1195-1202
  • DOI: 10.1111/hepr.12488.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Differences in serum microRNA profiles in hepatitis B and C virus infection. (2015)
  • Author(s): Akamatsu S., Hayes C.N., Tsuge M., Miki D., Akiyama R., Abe H., Ochi H., Hiraga N., Imamura M., Takahashi S., Aikata H., Kawaoka T., Kawakami Y., Ohishi W. and Chayama K.
  • Journal Title: Journal of Infection Volume: 70 Pages: 273-87
  • DOI: 10.1016/j.jinf.2014.10.017.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Human Cytotoxic T Lymphocyte-Mediated Acute Liver Failure and Rescue by Immunoglobulin in Human Hepatocyte Transplant TK-NOG Mice. (2015)
  • Author(s): Uchida T., Hiraga N., Imamura M., Tsuge M., Abe H., Hayes C.N., Aikata H., Ishida Y., Tateno C., Yoshizato K., Ohdan H., Murakami K. and Chayama K.
  • Journal Title: Journal of Virology Volume: 89 Pages: 10087-96
  • DOI: 10.1128/JVI.01126-15.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] HBV RNA量を用いた核酸アナログ中止後再燃予測 (2015)
  • Author(s): 柘植雅貴、川上広育、茶山一彰
  • Organizer: 第42回日本肝臓学会西部会（パネルディスカッション）
  • Place of Presentation: 名古屋
  • Year and Date: 2015-11-25 – 2015-11-25
• [Presentation] Difference of intracellular responses by HBV genotype A and C infection in humanized mouse model (2015)
  • Author(s): Masataka Tsuge, Nobuhiko Hiraga, Hiromi Abe, Daiki Miki, Michio Imamura, Hidenori Ochi, C Nelson Hayes, Kazuaki Chayama
  • Organizer: AASLD2016（ポスター）
  • Place of Presentation: 米国（サンフランシスコ）
  • Year and Date: 2015-11-16 – 2015-11-16
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] B型肝炎治療の現状 (2015)
  • Author(s): 柘植雅貴
  • Organizer: JDDW 2015（ランチョンセミナー）
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-10-09 – 2015-10-09
  • Invited
• [Presentation] HBV genotype C感染例におけるHBs抗原消失に関する検討 (2015)
  • Author(s): 柘植雅貴、村上英介、茶山一彰
  • Organizer: JDDW 2015（ワークショップ）
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-08
• [Presentation] HBV genotypeと核酸アナログの抗ウイルス効果 (2015)
  • Author(s): 柘植 雅貴、村上英介、平賀 伸彦、阿部弘美、今村 道雄、秋田智之 、田中純子 、茶山 一彰
  • Organizer: 第11回広島肝臓プロジェクト研究センターシンポジウム（一般演題）
  • Place of Presentation: 広島
  • Year and Date: 2015-07-04 – 2015-07-04
• [Presentation] HBV感染に伴うmicroRNA発現変化と miRNAによるHBV複製制御 (2015)
  • Author(s): 柘植雅貴、平賀伸彦、村上英介、阿部弘美、三木大樹、河岡友和、平松 憲、今村道雄、川上由育、相方 浩、越智秀典、茶山一彰
  • Organizer: 第51回日本肝臓学会総会（一般演題）
  • Place of Presentation: 熊本
  • Year and Date: 2015-05-22 – 2015-05-22
• [Presentation] 核酸アナログ中止例における HBVコア蛋白のアミノ酸変異に関する解析 (2015)
  • Author(s): 村上英介、柘植雅貴、内田宅郎、菅 宏美、柾木慶一、本田洋士、中原隆志、大野敦司、平賀伸彦、河岡友和、平松 憲、今村道雄、相方 浩、茶山一彰、川上広育
  • Organizer: 第51回日本肝臓学会総会（一般演題）
  • Place of Presentation: 熊本
  • Year and Date: 2015-05-22 – 2015-05-22
• [Presentation] 当院におけるHBVキャリアのHBs抗原陰性化と肝発癌に関する検討 (2015)
  • Author(s): 村上英介、柘植雅貴、茶山一彰
  • Organizer: 第101回日本消化病学会総会（シンポジウム）
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2015-04-16 – 2015-04-16
• [Presentation] 核酸アナログ先行投与によるインターフェロン反応性の変化 (2015)
  • Author(s): 柘植雅貴、平賀伸彦、茶山一彰
  • Organizer: 第101回日本消化病学会総会（ワークショップ）
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2015-04-14 – 2015-04-14
• [Patent(Industrial Property Rights)] 高力価のB型肝炎ウイルスを産生する細胞およびその作製方法 (2015)
  • Inventor(s): 柘植雅貴、茶山一彰
  • Industrial Property Rights Holder: 柘植雅貴、茶山一彰
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: JP2015/081135
  • Filing Date: 2015-04-10