肝線維化における自然免疫を介した肝再生への誘導

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09014
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 阿部 和道 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (30468128)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大平 弘正 福島県立医科大学, 医学部, 教授 (90274951)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 樹状細胞 / 肝線維化

Outline of Annual Research Achievements

【背景と目的】肝線維化進展・制御のメカニズムにおける古典的樹状細胞（conventional DC:cDC）の役割はまだ十分に理解されていない。また、Toll-like receptor (TLR) は自然免疫の認識機構のひとつであり、TLR9のリガンドであるCpG DNA (CpG)がcDCを活性化し肝線維化を改善させる可能性がある。本研究では、肝線維化におけるcDCの役割を解明することを目的とする。
【方法】実験1：B6マウスに四塩化炭素（CCl4）を繰り返し皮下投与して肝線維化モデルを作成し、CCl4投与開始4週間後にCpG を週1回皮下投与し、CCl4投与開始8週間後に肝臓を摘出し検討した。実験2：B6マウスの骨髄を採取し、GMCSFを投与して培養で得たcDCをCpGで24hr刺激する。採取した上清でIL-10、TNFα、IL-6をELISAで測定した。実験３：マクロファージ細胞株（RAW246.7）に対しrIL-10添加し、その後、LPSで刺激後にTNF-αやIL-6産生を抑制するかELISAで評価した。実験４：ジフテリアトキシン（DT）を投与することでcDCが枯渇する遺伝子導入マウス(DTR)を使用し、CCl4を繰り返し皮下投与し、生存率、肝組織を評価した。
【結果】結果１：CpG投与群では、非CpG投与群と比較して、有意に肝線維化を抑制した。また、血漿ヒアルロン酸値、肝臓ヒドロキシプロリン値が低下、αSMA発現やTIMP1mRNA発現も低下した。結果２：cDCはCpGの刺激で炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカイン（IL-10）を産生した。結果３： IL-10は、LPSの刺激による活性化マクロファージが産生する炎症性サイトカインを抑制した。結果４：DTを投与した群は非投与群と比較して有意に生存率が低下し、ALT高値、さらに肝線維化が悪化した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

DTRマウスの検疫、搬入、繁殖に時間がかかったため

Strategy for Future Research Activity

DTRマウスにCCl4を繰り返し皮下投与（0.5 mL/Kg、週2回、6週間投与）して肝線維化モデルを作成し、CCl4投与開始3週間後からCpG (10μg/mouse)を週1回皮下投与する。そこにDT投与群と非投与群で肝線維化やサイトカイン（Bio-Plexで測定）評価し比較する。

Causes of Carryover

実験で使用する遺伝子組み換えマウスの搬入、検疫、繁殖に時間がかかり、予定していた実験の実施が大幅に遅れてしまったため。