2015 Fiscal Year Research-status Report

C型肝炎の病態増悪に関わる腸内細菌叢由来因子の同定

Research Project

Project/Area Number	15K09015
Research Institution	Nagoya City University
Principal Investigator	井上貴子名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00431700)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	腸内細菌叢 / C型肝炎ウイルス / 次世代シーケンサー / メタボローム解析
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は、C型慢性肝炎の病態進展度による腸内細菌叢の特徴を明らかにし、腸内細菌由来の肝病態増悪因子を同定し、その作用機序を解明することである。研究期間開始前に得られた結果から、肝硬変症例と無症候性キャリア症例で腸内細菌叢構成菌種の相違が見いだされた。本年度は1．肝病態進展度の異なるHCV感染症例の腸内細菌叢の比較、2．メタボローム解析の計画立案と着手を行った。 1．肝病態進展度の異なるHCV感染症例の腸内細菌叢の比較：名古屋市立大学病院および研究協力機関に通院中のHCV感染症例で、糞便提供に同意した患者を対象とした。名古屋市立大学で糞便から腸内細菌ゲノムDNAを抽出し、細菌ゲノムDNAを鋳型に16S ribosomal RNA遺伝子を網羅的に増幅させるPCRを行った。その後研究協力機関で、次世代型超高速DNA シーケンサーIllumina MiSeq 2000を用いて塩基配列を決定した。得られた塩基配列は菌叢データに変換し、比較解析に用いた。細菌叢データを統計学的に検討した結果、C型肝炎の病態進展（肝線維化の増悪、肝硬変への移行）に関連する菌種を同定した。当初肝硬変と無症候性キャリア症例のみを研究対象としたが、両者の移行病態として慢性肝炎症例も対象に含め解析を行った。 2．メタボローム解析の計画立案と着手：腸内細菌叢データから典型的な10サンプルを選択した。現在、島津有機酸分析システムを用いた高速液体クロマトグラフィ（HPLC）で、糞便中のコハク酸、乳酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、iso-酪酸、ｎ-酪酸、iso-吉草酸、n-吉草酸の定量分析を施行している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason これまでに肝病態進展度の異なるHCV感染症例の腸内細菌叢を比較し、典型的な症例のメタボローム解析の計画立案と着手を行った。 1．肝病態進展度の異なるHCV感染症例の腸内細菌叢比較： HCV感染症例で糞便提供に同意した患者170例（肝硬変61例うち肝癌合併21例、慢性肝炎91例うち肝癌合併3例、無症候性キャリア18例）を対象とした。名古屋市立大学で腸内細菌ゲノムDNAを抽出し、細菌ゲノムDNAを鋳型に16S ribosomal RNA遺伝子を網羅的に増幅させるPCRを行った。研究協力機関で次世代型超高速DNA シーケンサーを用いて腸内細菌叢の塩基配列を決定し、得られた塩基配列を菌叢データに変換し比較解析を行った。統計学的検討の結果、C型肝炎の病態進展すなわち肝硬変と関連する菌種としてOtu40が同定された。HCV感染症例を肝硬変・慢性肝炎・無症候性キャリアの3病期に分けた比較検討で、Otu40は肝硬変症例で有意に増加していた。また肝線維化の客観的な指標としてFib4-indexを用いた解析では、Fib4-index 3.25以上の肝線維化進展症例でOtu40が高頻度に検出された。なお、肝癌と関連する菌種は同定されていない。 2．メタボローム解析の計画立案と着手：腸内細菌叢データからOtu40を菌叢に持つ7サンプルと、持たない3サンプルをパイロットスタディとして選択した。Otu40は酪酸産生菌である。現在島津有機酸分析システムを用いた高速液体クロマトグラフィ（HPLC）で、糞便中のコハク酸、乳酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、iso-酪酸、ｎ-酪酸、iso-吉草酸、n-吉草酸の定量分析を行っている。
Strategy for Future Research Activity	今後1．メタボローム解析の継続、2．C型肝炎病態増悪因子の予測と精製、3．抗HCV治療前後の腸内細菌叢の変化、4．HCV排除後の肝発がん・インスリン抵抗性と腸内細菌叢との関係を明らかにするための前向き研究、を推進する。 1．メタボローム解析：施行中のメタボローム解析の結果から、C型肝炎病態増悪につながる腸内細菌代謝産物を同定する。現在島津有機酸分析システム（HPLC）を用いた解析を行っているが、困難な場合は解析サンプルの追加、別の分離・同定システムへの変更を行う。CE-TOF MS（キャピラリー電気泳動＋飛行時間型質量分析）は理論上HPLCよりも分離能がよくGC（ガスクロマトグラフィ）より広範囲の化合物を検出できるため、同システムへの変更も検討する。 2．C型肝炎病態増悪因子の予測と精製：メタボローム解析から腸内細菌叢由来のC型肝炎増悪因子を予測し、精製を試みる。目的とする肝病態増悪因子の性質に応じて、精製方法を選択する。予測された因子が既知の単純化合物であった場合、この過程は省略する。 3．抗HCV治療前後の腸内細菌叢の変化：直接作用型抗ウイルス剤（DAAs）によってHCV排除に至った症例のウイルス排除前後の腸内細菌叢を比較し、HCV感染状態と関連する菌種を同定する。 4．HCV排除後の肝発がん・インスリン抵抗性と腸内細菌叢との関係：DAAsによりHCVは排除可能となるが、現段階では肝がん発生を抑止することは困難である。またC型肝炎ではインスリン抵抗性と肝病態進展との関連が報告されている。これらの病態を網羅する前向き研究を立案し、対象症例の観察を開始する。並行してHCV感染ヒト肝細胞キメラマウスに肝病態増悪因子を投与し、肝組織の炎症や肝線維化の程度を経時的に比較する。期間終了後は腸内細菌を利用した肝硬変の新規治療法の確立、肝疾患進行マーカーの発見と開発へ研究を発展させる。
Causes of Carryover	糞便メタボローム解析への支出が次年度に繰越となった。腸内細菌叢データからパイロットスタディとして10サンプルを選択し、島津有機酸分析システムを用いた高速液体クロマトグラフィ（HPLC）で、糞便中のコハク酸、乳酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、iso-酪酸、ｎ-酪酸、iso-吉草酸、n-吉草酸の定量分析を行っている。
Expenditure Plan for Carryover Budget	今後糞便メタボローム解析の結果を判断し、C型肝炎病態増悪につながる腸内細菌代謝産物を同定する。現在HPLCを用いた解析を行っているが、困難な場合は解析サンプルの追加、別の分離・同定システムへの変更を行う。CE-TOF MS（キャピラリー電気泳動＋飛行時間型質量分析）は理論上HPLCよりも分離能がよくGC（ガスクロマトグラフィ）より広範囲の化合物を検出できるため、同システムへの変更も検討する。メタボローム解析と並行してHCV感染ヒト肝細胞キメラマウスに肝病態増悪因子を投与し、肝組織の炎症や肝線維化の程度を経時的に比較する実験を計画する予定である。