2016 Fiscal Year Research-status Report
脂肪性肝炎の代謝病態におけるリピドラフト構造変化と機能的役割の解明
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15K09022
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
内山 明 順天堂大学, 医学部, 准教授 (60529254)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩渕 和久 順天堂大学, 医療看護学部, 教授 (10184897)
池嶋 健一 順天堂大学, 医学部, 先任准教授 (20317382)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | リピドラフト / NASH / 遊離脂肪酸 / インスリン抵抗性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
C57BL/6雄性マウスより単離した初代培養肝細胞の系を用いた。肝細胞内の脂肪沈着をOil Red O染色で可視化しmicroplate readerを用いて定量した。Propidium iodide、dichlorofluorescin diacetateで染色し蛍光増強をmicroplate readerで経時的に計測し細胞死およびreactive oxygen species (ROS)の産生を評価した。スフィンゴ糖脂質の免疫細胞染色を行いconfocal laser microscopyでリピドラフトの形態変化を評価しクラスター化率を算出した。IRS-2のチロシンリン酸化（pIRS-2）をELISA法、Aktのリン酸化（pAKT）をwestern blotで測定した。実験結果では、パルミチン酸（PA群；0.6 mM）を培養液中に添加すると肝細胞内の脂肪滴の沈着が有意に認められた（p＜0.01）。リピドラフトのクラスター化は対照群23.5±4.7％に対しPA群では 36.8±2.5％と有意に増加した(p＜0.05)。 PA群に極低濃度のtert-butylhydroperoxide（25μM）を負荷してラジカルを誘導するとROSの産生は約3.2倍に細胞死は約8.9倍に増加した。細胞膜上のコレステロールを調節するcholesterol oxidase（CHOX; 0.1U）を前処置することでPAの添加で生じたリピドラフトのクラスター化は抑制されROSの産生は約18%軽減し細胞死は約21%抑制された（p＜0.05）。インスリン(1 ng/ml)刺激に伴うpIRS-2、pAKTの上昇は、PAの添加により有意に抑制された。その事象はCHOXの前処置で生じなくなった（p＜0.05）。以上の事象より、遊離脂肪酸負荷による細胞膜上のリピドラフトの形態変化は、インスリンシグナル伝達を負に制御し酸化ストレス応答性の亢進および肝細胞死に関与していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度において、インスリン抵抗性とリピドラフトの形態変化を検討することを予定していた。計画通りに、実験結果を示すことが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
腸管細菌叢とリピドラフトの関与の検討を目的とする。
NASHモデルマウスを作成し、Kupffer 細胞を分離培養する。脂質負荷に伴うKupffer細胞膜上の脂質組成変化とピドラフトの形態変化を調べる。LPSを用いKupffer細胞のリピドラフトの形態変化と炎症性サイトカイン産生を評価する。NASHモデルマウスにおいて、プロバイオティクスを投与群と比較し腸内細菌叢とリピドラフトの変化について検討する。
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| Causes of Carryover |
平成28年度に、インスリン抵抗性の解析を行う上で、当初mRNA測定を検討していたが、ウエスタンブロット法で結果を得られた。インスリンシグナルの下流および糖新生の関与を測定を次年度する予定となった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度に測定したサンプルをもとに、インスリンシグナルおよび解糖系に関わるmRNAの発現レベルを測定する。脂肪負荷に伴う腸内細菌叢の変化とインスリンシグナル伝達を比較する。
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