iPS細胞から肝細胞の製造を目指した肝細胞分化の解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K09032
• Research Institution: 独立行政法人国立病院機構 下志津病院(臨床研究部)
• Principal Investigator: 富澤 稔 独立行政法人国立病院機構下志津病院(臨床研究部), その他部局等, その他 (90334193)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ブドウ糖 / アルギニン / ガラクトース / オルニチン / 転写因子 / 肝細胞

Outline of Annual Research Achievements

ブドウ糖、アルギニンを除き、ガラクトースとオルニチンを添加し、oncostatin M等を添加したhepatocytee differentiation inducer(HDI)でヒトinduced pluripotent stem(iPS)細胞を培養すると肝細胞への分化を開始する。しかし7日で細胞は死滅する。そこで今年度はHDIと組み合わせて使用する市販培地を検討した。またiPS細胞から肝細胞への分化を促進する転写因子の組み合わせを検討した。
iPS細胞をHDIで2日培養後市販培地に変更後7日培養し、RNAを抽出してリアルタイム定量PCR(qPCR)にて未分化な肝細胞のマーカーであるalpha-feto protein(AFP)の発現量を解析した。iPS細胞とヒト肝臓から抽出したRNA(Clontech)でcDNAマイクロアレイ解析を行い、肝細胞に特異的に発現している転写因子の解明を試みた。これらの転写因子の発現プラスミドを作成し、iPS細胞に導入後RNAを抽出してqPCRにてAFPの発現量を解析した。
HDIに続いてWilliams’ E(WE)培地で培養するとAFPの発現量が最も亢進することが判明した。
CCAAT/enhance binding protein (C/EBP)α、C/EBPβ、forkhead box protein (FOX)A1, FOXA3を同時にiPS細胞に導入するとAFPの発現量が最も亢進することが判明した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

HDIにつづけて使用する培地が比較的早期に明らかになった。cDNAマイクロアレイにおいて既存の文献を用いた絞り込みが比較的早期に終了した。

Strategy for Future Research Activity

ブドウ糖、アルギニンがなく、ガラクトースとオルニチンを添加した培地で長期間培養すると効率的にiPS細胞が肝細胞に分化することが期待される。そこで解糖系の阻害剤である3-bormopyruvate, 2-deoxy-d-glucoseをWEに添加してiPS細胞から肝細胞への分化誘導を試みる。

Research Products

• [Journal Article] An optimal medium supplementation regimen for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells (2015)
  • Author(s): Tomizawa M, Shinozaki F, Hasegawa R, Fugo K, Shirai Y, Motoyoshi Y, Sugiyama T, Yamamoto S, Kishimoto T, Ishige N
  • Journal Title: J Cell Biochem Volume: 116 Pages: 1479-1489
  • DOI: 10.1002/jcb.25139
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Involvement of Wnt pathway in feeder-free culture of human induced pluripotent stem cells (2015)
  • Author(s): Tomizawa M, Shinozaki, F, Motoyoshi, Y, Sugiyama, T, Shigenori Yamamoto, S, Ishige, N
  • Journal Title: Mol Med Rep Volume: 12 Pages: 6797-6800
  • DOI: 10.3892/mmr.2015.4314
  • Peer Reviewed
• [Presentation] iPS細胞から肝細胞への分化を促進する培地の開発 (2016)
  • Author(s): 富澤稔、篠崎文信、本吉慶史、杉山隆夫、山本重則、石毛尚起
  • Organizer: 第15回日本再生医療学会総会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2016-03-17 – 2016-03-19
• [Presentation] iPS細胞から肝細胞への分化を促進する培地の開発 (2015)
  • Author(s): 富澤稔、篠崎文信、本吉慶史、杉山隆夫、山本重則、石毛尚起
  • Organizer: 第19回日本肝臓学会大会
  • Place of Presentation: 品川
  • Year and Date: 2015-10-08 – 2015-10-11
• [Presentation] An optimal medium supplementation regimen for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells (2015)
  • Author(s): 15.Tomizawa M, Shinozaki F, Motoyoshi Y, Sugiyama T, Yamamoto S, Ishige N
  • Organizer: 13th Annual Meeting of International Society of Stem Cell Research
  • Place of Presentation: Stockholm, Sweden
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-27
  • Int'l Joint Research